防治地黃連作障礙有益細(xì)菌生物學(xué)特性及大田定殖能力的研究.pdf

1、地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）連作障礙是阻礙地黃產(chǎn)量增加的主要原因之一，尋找克服地黃連作障礙的方法是目前中藥學(xué)研究的熱點(diǎn)課題之一。研究認(rèn)為地黃連作導(dǎo)致根際微生物區(qū)系失衡是連作障礙發(fā)生的主要原因之一。本研究對(duì)克服地黃連作障礙的有益菌株活性及大田定殖能力進(jìn)行研究，主要目的是利用有益菌株克服地黃連作障礙。
　　利用菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期研究得到的對(duì)克服地黃連作障礙的有益菌株：1~10

2、號(hào)菌進(jìn)行傳統(tǒng)方法的鑒定；并利用分子生物學(xué)手段，將菌株16SrDNA序列經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast比對(duì)后，結(jié)合傳統(tǒng)鑒定結(jié)果，最終鑒定1~10號(hào)菌株分別為：1、6、9號(hào)菌為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），2號(hào)菌為短黃桿菌（Myroides odoratimimus），3號(hào)菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）4號(hào)菌為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）5號(hào)為嗜冷桿菌（Psychroba

3、cter alimentarius），7、10號(hào)菌為球形節(jié)桿菌（Arthrobacter aurescens.），8號(hào)菌為普通變形菌（Proteus vulgaris）。
　　為了方便菌種的保藏及滿足菌種開發(fā)的要求，對(duì)各菌株生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基、pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速及保藏條件進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明：適合在 LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的為2、3、5、7、9、10號(hào)菌；適合在NB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的為1、4、6、8號(hào)菌；適合在pH值為7的條件下生長(zhǎng)的

4、為1、3、4、10號(hào)菌；適合在pH值為8的條件下生長(zhǎng)的為2、5、6、7、8、9號(hào)菌；適合在28℃條件下生長(zhǎng)的為1、2、3、6、8、9、10號(hào)菌；適合在30℃條件下生長(zhǎng)的為4、7號(hào)菌；適合在25℃條件下生長(zhǎng)的為5號(hào)菌；適合斜面?zhèn)鞔２氐木N為1、3、6號(hào)菌；適合斜面保藏的菌株為2、7、9、10號(hào)菌；適合液體甘油法保藏的菌株為1、3、4、5、6、7、8、9、10號(hào)菌；適合穿刺保藏的菌株為2號(hào)菌；適合砂土管保藏的菌株為2、4、5、8號(hào)菌；適合

5、超低溫冷凍保藏的菌株為1、3、4、5、6、7、8、9、10號(hào)菌。
　　MS培養(yǎng)基中添加生地提取液可以使地黃苗死亡，用1~10號(hào)菌分別對(duì)組培苗進(jìn)行浸根處理后，地黃苗都能夠成活，但是各菌株作用效果有差異，比較各菌處理的地黃組培苗生長(zhǎng)速度及植株長(zhǎng)勢(shì)，其中9號(hào)菌作用效果最明顯，因此選擇9號(hào)菌作為施入大田的有益菌株，根據(jù)其假單胞菌的特性，利用三親本雜交法對(duì)其進(jìn)行 Lux發(fā)光酶基因標(biāo)記，標(biāo)記成功的菌株命名為 C-9號(hào)菌，比較標(biāo)記前后菌株的生理

6、生化等性質(zhì)及標(biāo)記前后菌株對(duì)地黃組培苗的作用效果，差異不顯著(P>0.05)。
　　將C-9號(hào)菌施入無(wú)菌栽培的地黃盆栽苗根部，每隔5天取樣觀察C-9號(hào)菌在盆栽中的定殖，發(fā)現(xiàn)其在盆栽中連續(xù)存在95天左右；將C-9號(hào)菌培養(yǎng)液施入大田后，每隔5天取樣觀察，發(fā)現(xiàn)其在大田條件下能夠存在55天左右，且施入大田后，前期土壤中細(xì)菌、真菌數(shù)量都顯著增多(P<0.05)，放線菌數(shù)量顯著減少了；后期隨著土壤中C-9號(hào)菌數(shù)量的減少(P<0.05)，細(xì)菌、真