攜帶人HCN4與Tbx3基因慢病毒共轉(zhuǎn)染對(duì)胚胎干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、目的：
　　 電子起搏器的局限性促使人們?cè)诰徛孕穆墒С５闹委熤袑ふ倚碌耐緩胶头椒?，體外重新構(gòu)建具有竇房結(jié)功能的細(xì)胞便是嘗試之一。目前主要以HCN4基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其雖能分化成心肌樣細(xì)胞，但由于缺乏竇房結(jié)標(biāo)記基因，功能上與竇房結(jié)細(xì)胞仍有差距。Tbx3基因在胚胎發(fā)育成熟晚期存在于竇房結(jié)前體細(xì)胞中使之保留起搏功能并抑制竇房結(jié)前體細(xì)胞向心房肌細(xì)胞分化。同時(shí)Tbx3與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤都存在T

2、bx3基因的過表達(dá)。本研究擬構(gòu)建同時(shí)攜帶有人。HCN4基因、Tbx3基因及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的慢病毒顆粒，并研究HCN4和Tbx3對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，為進(jìn)一步通過HCN4、Tbx3共表達(dá)重建竇房結(jié)細(xì)胞功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、慢病毒包裝及滴度測(cè)定
　　 用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別包裹攜帶有目的基因的

3、hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四種目的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞，分別產(chǎn)生含有表達(dá)hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP基因的四種慢病毒顆粒，計(jì)數(shù)熒光克隆數(shù)目，并計(jì)算病毒滴度。
　　 2、干細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和篩選
　　 將獲得的四種慢病毒顆粒分別轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)染成功

4、的細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增并進(jìn)行挑克隆純化，RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。
　　 3、ES細(xì)胞生物學(xué)活性的評(píng)價(jià)
　　 觀察獲得的四種轉(zhuǎn)基因小鼠ES細(xì)胞的形態(tài)、熒光表達(dá)強(qiáng)度。MTT法測(cè)定各組ES細(xì)胞OD值，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1、hHCN4-hTbx3慢病毒顆粒的構(gòu)建
　　 四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞后，根據(jù)熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明成功構(gòu)建hHCN4-hTbx3-eGFP

5、、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四種慢病毒顆粒。病毒滴度測(cè)定結(jié)果分別為4.7×107TU/ml、5.2×107TU/ml、4.5×107TU/ml、6.7×107TU/ml。
　　 2、轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)
　　 四種慢病毒轉(zhuǎn)染后的ES細(xì)胞挑克隆純化后熒光表達(dá)正常，RT-PCR示目的基因表達(dá)良好。
　　 3、ES細(xì)胞形態(tài)、凋亡等變化
　　 四種轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞中，含hHC

6、N4-eGFP及eGFP細(xì)胞形態(tài)良好，熒光率較高，含hTbx3-eGFP和hHCN4-hTbx3-eGFP細(xì)胞狀態(tài)相對(duì)差，熒光雖然明顯，但表達(dá)不強(qiáng)，培養(yǎng)上清可見漂浮的死細(xì)胞。進(jìn)一步的MTT和流式細(xì)胞儀(AnnexinV-PE)檢測(cè)示hTbx3-eGFP、hHCN4-hTbx3兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，凋亡率顯著增高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建出HCN4-Tbx3基因的慢病毒顆粒。
　　 2