替硝唑?qū)M小鼠的亞急性毒性及利用RP-HPLC法對其在組織中代謝消除的檢測.pdf

1、替硝唑(TNZ)屬于硝基咪唑類藥物，在動物源性食品中的殘留對人具有潛在致癌性，農(nóng)業(yè)部規(guī)定在動物源性食品中的最大殘留限量為零。本研究通過對KM小鼠的血液、肌肉、肝臟的殘留檢測，選擇最適宜的TNZ殘留檢測部位；根據(jù)本實驗所使用的反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，為相關(guān)的檢測部門提供動物性食品中比較簡便可行的TNZ快速無損檢測的RP-HPLC法；探討TNZ對機體可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，為動物性食品的安全性提供可靠的毒理學(xué)依據(jù)；還根據(jù)RP-HP

2、LC法所測定的TNZ在血液、肌肉和肝臟中的濃度數(shù)據(jù)，模擬出TNZ在KM小鼠機體內(nèi)的代謝消除趨勢，由此測算其代謝消除時間，為推測動物性食品中TNZ代謝消除時間提供參考。 將100只實驗小鼠分為兩批。第一批60只KM小鼠分為5組，使用灌胃法每日按照100mg/kg體重的劑量灌胃TNZ藥液，連續(xù)5d。5d后，按照投藥后不同時間段進(jìn)行處死采樣。采樣結(jié)束后將血漿樣品在13000r/min，4℃離心10min，分離出血清以后，吸取0.5ml

3、血清加入0.2ml的甲醇，渦旋混合1min后再加入0.8ml乙腈，渦旋3-5min至混合均勻，靜置10min以上。然后以10000r/min，4℃離心10min后，再次以相同條件將上清液離心，取上清液進(jìn)行HPLC測定。肌肉、肝臟組織樣經(jīng)過勻漿處理后取0.5g，后面處理同血液樣品。 第二批40只KM小鼠進(jìn)行30d的蓄積性毒性實驗。分為4組，按照0mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg體重進(jìn)行灌胃TNZ藥

4、液。30d以后進(jìn)行處死采樣。進(jìn)行血液生化指標(biāo)測定的部分取0.3ml血清加入酶試劑以后，使用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測；進(jìn)行TNZ殘留含量測定的部分按照第一批血樣與組織樣的處理辦法處理后，上機檢測。 HPLC測定采用PhenomenexHypercloneBDS-C18柱(150×4.6mm,5μm)，以甲醇：水(25：75)為流動相，流速1.0ml/min。檢測溫度30℃，紫外檢測波長310nm。 結(jié)果表明，TNZ在血液與

5、肌肉的殘留期長，殘留量高，但是肌肉的回收率與精密度更好，所以應(yīng)該選擇肌肉作為檢測的目標(biāo)。為了防止漏檢，可同時檢測血液作為參考。 通過本實驗所采取的RP-HPLC法，可以實現(xiàn)TNZ在動物性食品中的快速無損檢測。樣品損耗少，檢出率高，相對回收率高，變異系數(shù)較小。在不同的組織中相對回收率不同。血液與肌肉的平均相對回收率＞95％，肝臟中平均相對回收率＞82％；血液與肌肉的日內(nèi)變異系數(shù)均＜7％；肝臟的平均日內(nèi)變異系數(shù)＜18％；日間變異系數(shù)

6、：肌肉(9％)＜血液(13％)＜肝臟(19％)。組織中的最低檢測限為1.25×10-5μg/ml，最低定量限為1.25×10-4μg/ml。樣品濃度范圍在0.008-111.26μg/ml時標(biāo)準(zhǔn)曲線與峰面積呈線性關(guān)系。 根據(jù)小鼠的臨床癥狀與病理變化以及臟器指數(shù)，可以得出TNZ對多種器官都有不利影響。血清生化指標(biāo)中A/G、白蛋白、尿素氮、肌酐這4個指標(biāo)，各實驗組的數(shù)值差異比較小。總蛋白、球蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶這

7、五個指標(biāo)各組數(shù)值差異較大，而且劑量組測定結(jié)果均高于對照組。多種指標(biāo)測定結(jié)果表明，TNZ的長時間使用可以導(dǎo)致各種器質(zhì)性與功能性的病變，尤其是大劑量的服用，此種不利影響尤為明顯?？梢缘贸鯰NZ的長期使用對多種器官、組織都有毒性。 TNZ在KM小鼠機體內(nèi)的代謝消除時間選擇代謝期長的血液與肝臟組織進(jìn)行計算，血液的代謝消除公式：Y=116.98e-0.3817x(R2=0.76)。當(dāng)血液中TNZ濃度要下降到0.001μg/ml需要30.5