江南卷柏提取物抗柯薩奇病毒和單純皰疹病毒的研究.pdf

1、江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron)是卷柏科卷柏屬植物江南卷柏的干燥全草，為常用中草藥與民族藥[1]。具有清熱解毒、抗癌、止血之功效，用于癌癥、肺炎、急性扁桃體炎、眼結(jié)膜炎和乳腺炎等癥[2]。云南彝族主要用于治療黃疸型肝炎、肺結(jié)核咯血、全身浮腫等癥。鄂西土家族尚用于癌癥、腹瀉、淋病、小兒驚風(fēng)、吐血、便血、崩漏、痔瘡出血，外用則治燒燙傷、外傷出血。并且，以本品為原料制得的江南卷柏片對(duì)原發(fā)性血小板減少

2、性紫癲、過(guò)敏性紫癲、繼發(fā)性紫癲及多種出血癥均有良效[3]。 目前，中外植物化學(xué)工作者已從卷柏屬植物中分離出黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸及多糖類(lèi)等多種化學(xué)成分[4]。其研究工作主要集中在植物的乙酸乙酯及正丁醇萃取部位，并從前者中成功分離了幾十個(gè)黃酮類(lèi)化合物，且除芹菜素外大多為雙黃酮類(lèi)[5]。其中，穗花杉雙黃酮(amentoflavone)不僅含量通常為最高，且最早即被1971年Okigawa，等人從卷柏中分離得到[6]

3、。 我們課題組從卷柏屬植物分離得到19個(gè)雙黃酮化合物、1個(gè)黃酮類(lèi)化合物和1個(gè)黃酮苷化合物，其中5個(gè)為新化合物，15個(gè)成分為首次從這些植物中發(fā)現(xiàn)，它們都具有一定程度抑制XOD、LOX或/和COX-2的活性；發(fā)現(xiàn)穗花衫雙黃酮、羅波斯塔黃酮和羅波斯塔黃酮—4ˊ—甲醚3種雙黃酮成分為卷柏屬植物共同的特征性成分，它們具有不同程度的抗氧化、抗病毒或抗腫瘤活性，是共同的活性指標(biāo)成分。其中從江南卷柏的活性部位分離得到了6個(gè)雙黃酮類(lèi)化合物，經(jīng)鑒定

4、為雞毛松雙黃酮A(7，4′，7″—tri—O—methylrobustaflavone，Ⅰ)、雞毛松雙黃酮B(7，7″—di—O—methylrobustaflavone，Ⅱ)、羅波斯塔黃酮-4′-甲醚(4'—O—methylrobustaflavone，Ⅲ)、羅波斯塔黃酮(robustaflavone，Ⅳ)，扁柏雙黃酮(hinokiflavone，Ⅴ)和穗花杉雙黃酮(amentoflavone，Ⅵ)。其中，化合物Ⅰ—Ⅴ為首次從江南卷柏

5、中分離得到，化合物Ⅰ和Ⅱ(雞毛松雙黃酮A和B)屬于羅波斯塔黃酮類(lèi)，只被報(bào)道發(fā)現(xiàn)于裸子植物羅漢松科羅漢松屬的雞毛松(Podocarpus imbricatus)，這是首次從其它植物和卷柏屬植物中分離得到[7]。 研究中還發(fā)現(xiàn)，卷柏屬植物江南卷柏、細(xì)葉卷柏及薄葉卷柏等均具有良好的體外抗柯薩奇病毒效果[8]。其中，江南卷柏的乙酸乙酯提取物不僅可直接殺死病毒，還能有效抑制病毒的生物合成[9]。而乙酸乙酯部位的主要特征成分之一是黃酮類(lèi)化合

6、物，故我們從江南卷柏藥材中提取出有效部位總黃酮成分，并考察其工藝和質(zhì)量，從而初步制定江南卷柏總黃酮提取物的制備工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。然后，以此提取物進(jìn)行了多次體外和體內(nèi)抗柯薩奇病毒(CVB3)和單純皰疹病毒(HSV—Ⅰ)的研究，取得了肯定且可靠的效果。 首先，在江南卷柏提取物制備工藝方面，我們通過(guò)單因素試驗(yàn)考察其粗提方法，確定為乙醇回流法；再以總黃酮提取量和浸膏得率為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)法對(duì)乙醇回流提取工藝進(jìn)行考察，確定其最佳工藝條件

7、為藥材9倍量的85％乙醇回流提取2次，每次1小時(shí)；接著以穗花杉雙黃酮提取量和浸膏得率為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)法對(duì)醇提物的石油醚脫脂工藝進(jìn)行考察，確定其最佳工藝條件為用原藥材6倍量的石油醚回流提取2次，每次1小時(shí)；脫脂后以低濃度稀醇溶液溶解過(guò)濾，再用大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化分離，得到最終產(chǎn)品：總黃酮粉末。具體即以總黃酮的含量和回收率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)樹(shù)脂的型號(hào)、藥材上樣量、洗脫劑濃度和體積、洗脫流速及樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)進(jìn)行考察，確定其最佳工

8、藝為用D101型大孔樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行吸附純化，樹(shù)脂量：藥材量為3：1，以8BV70％乙醇溶液在2BV/h的流速進(jìn)行洗脫，樹(shù)脂的重復(fù)使用次數(shù)為3次。 在江南卷柏提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，以紫外分光光度法和高效液相色譜法對(duì)提取物的總黃酮含量及穗花杉雙黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)考察，規(guī)范以上述制備工藝所制得總黃酮提取物，其總黃酮含量不少于50.0％，穗花杉雙黃酮含量不少于35.0％。 同時(shí)，我們還制定了江南卷柏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定其

9、名稱(chēng)、來(lái)源、性狀，鑒別、含量測(cè)定、炮制、性味歸經(jīng)、功能與主治、用法與用量及貯藏。在含量測(cè)定中，是以穗花杉雙黃酮為對(duì)照品，采用高效液相色譜法，測(cè)定穗花杉雙黃酮的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。最后暫定本品以干燥品計(jì)含穗花杉雙黃酮不得少于0.30％。 接著，對(duì)江南卷柏提取物的體外抗病毒作用進(jìn)行了研究。我們選擇柯薩奇病毒(CVB3)及單純皰疹病毒(HSV—Ⅰ)，根據(jù)其復(fù)制周期，設(shè)計(jì)藥物抗病毒作用的三種途徑(抗病毒吸附、對(duì)病毒直接滅活、對(duì)病毒

10、增殖的抑制作用)，分三個(gè)處理組進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，江南卷柏提取物的TC50為60μg/ml。故在此范圍內(nèi)確定5，10，20，30，40，50μg/ml作為藥物終濃度進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗CVB3效果方面，其直接滅活病毒作用的IC50為36μg/ml，最高病毒抑制率為60％，TI為1.7；其抑制病毒增殖作用的IC50為16μg/ml，最高病毒抑制率為70％，TI為3.8。抗HSV—Ⅰ效果方面，其直接滅活病毒作用的IC50

11、為21μg/ml，最高病毒抑制率為80％，TI為2.9；其抑制病毒增殖作用的IC50為12μg/ml，最高病毒抑制率為90％，TI為5.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明江南卷柏提取物不僅細(xì)胞毒性較低，且具有較好的直接殺死病毒和抑制病毒生物合成的作用，其生物效價(jià)較高。 最后，我們對(duì)江南卷柏提取物在體內(nèi)抗柯薩奇病毒的療效進(jìn)行了重點(diǎn)研究。小鼠的動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)表明，當(dāng)以0.2ml/10g一次性灌胃、給藥濃度依次為4.0，5.0，6.3，7.9，10m

12、g/g時(shí)，其死亡率分別為10％，30％，60％，80％，100％，故確定江南卷柏標(biāo)準(zhǔn)提取物的LD50為6.2mg/g。則在此范圍內(nèi)確定0.9，0.3，0.1mg/g作為高、中、低三種藥物濃度進(jìn)行抗病毒治療。 選取小鼠(km SPF級(jí)雄性，體重10±2g)作為試驗(yàn)動(dòng)物，用0.2mlCVB3原液(TCID50為10-7)腹腔注射建立了病毒感染誘發(fā)小鼠病毒性心肌炎致病模型，然后分別設(shè)立高、中、低三種濃度的藥物治療組，正常對(duì)照組，病毒模

13、型對(duì)照組和阿昔洛韋陽(yáng)性藥物對(duì)照組，于病毒感染后24h開(kāi)始治療，采取灌胃給藥形式，每日一次，其余各組則采用生理鹽水灌胃，每日一次，連續(xù)治療15天。結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度為0.1mg/g時(shí)，其治愈率為30％，死亡率為50％；當(dāng)藥物濃度為0.3mg/g時(shí)，其治愈率為50％，死亡率為20％；當(dāng)藥物濃度為0.9mg/g時(shí)，其治愈率為70％，死亡率為10％。綜合各項(xiàng)考察指標(biāo)，結(jié)果顯示總黃酮提取物能有效抑制柯薩奇病毒在小鼠體內(nèi)的增殖，保護(hù)其臟器組織，明

14、顯減輕發(fā)病癥狀，推遲死亡時(shí)間，降低死亡率，治療呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 本文研究發(fā)現(xiàn)，江南卷柏提取物的細(xì)胞毒性(TC50為60μg/ml)和動(dòng)物毒性(LD50為6.2mg/g)均較小，在體外有顯著抑制柯薩奇病毒和單純皰疹病毒增殖的作用，體內(nèi)能有效地治療柯薩奇病毒感染誘發(fā)的病毒性心肌炎小鼠，是一種新的潛在性有效的抗柯薩奇病毒和單純皰疹病毒的藥物。江南卷柏在民間已經(jīng)用于多種病毒性疾病，本研究為治療危急性的病毒性心肌炎提供了新的依據(jù)和希望