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文檔簡介
1、基因轉(zhuǎn)運載體的選擇,是保障系統(tǒng)能夠高效、安全地攜帶基因作用于靶向部位、有效發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。層狀復(fù)合氫氧化物(Layered Double Hydroxides,LDHs),具有水滑石層狀晶體結(jié)構(gòu),層片由兩種或兩種以上的金屬元素構(gòu)成,層板帶正電荷,層間存在可交換的陰離子。DNA可插入層間與LDH層板建立靜電、氫鍵作用以及發(fā)生空間位阻效應(yīng),使LDHs/DNA雜化復(fù)合物具有特殊的細(xì)胞傳輸性能、良好的生物相容性、有利于降解以及控制釋放等優(yōu)勢
2、,因此LDH作為一種新型的基因轉(zhuǎn)運載體受到廣泛的關(guān)注和開發(fā)。
本文將DNA作為客體分子,以順磁性的鐵系離子構(gòu)成層板的磁性層狀復(fù)合氫氧化物(Magnetic Layered Double Hydroxides,MLDH)為載體,研究磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)(MLDH/DNA)的制備、細(xì)胞內(nèi)化及其體內(nèi)磁靶向轉(zhuǎn)運效果,為磁性層狀復(fù)合氫氧化物應(yīng)用于基因載體提供實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。本文的主要研究內(nèi)容包括以下三個部分:
3、 1.磁性層狀復(fù)合氫氧化物基因運載系統(tǒng)構(gòu)筑表征
用共沉淀法合成的MLDH作為載體,以表達(dá)綠色熒光蛋白的pEGFP-N1或鮭魚精DNA為客體,通過共沉淀和離子交換反應(yīng)方法,制備磁性MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物;利用粉末X射線衍射、紅外光譜分析及熱重分析方法進(jìn)行了物相表征,通過凝膠阻滯實驗評價了不同條件下MLDH對DNA的結(jié)合與保護(hù)效果。XRD分析表明,MLDH具有六方晶系特征,DNA會干擾MLDH的層狀堆積秩序,但LDH層板結(jié)
4、構(gòu)在復(fù)合物中得到保留。Fe-O-Fe間距發(fā)生微小調(diào)整,MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物的(006)晶面衍射強(qiáng)度增大,并在14~17°區(qū)間出現(xiàn)新的晶相衍射。IR光譜證明,MLDH/DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)中MLDH與客體DNA共存、并發(fā)生了有效復(fù)合。MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物在67.7~650.0℃溫度區(qū)間,表現(xiàn)有三個失重段,分別與濕固相的含水量、LDH層板羥基的脫水縮合和層間有機(jī)殘基復(fù)合物的深度分解相關(guān)。透射電鏡觀察顯示,MLDH的層狀特征比普
5、通LDH強(qiáng),但六邊形的不規(guī)則程度高,與DNA結(jié)合的親和力強(qiáng),可形成大小不一、形狀不同的轉(zhuǎn)運復(fù)合物。凝膠阻滯實驗表明,MLDH能夠有效結(jié)合分子量小于1Kb的DNA。在不同pH條件下,尤其在酸性條件下,磁性層狀復(fù)合氫氧化物能夠有效保護(hù)層間DNA分子,低于生理條件的核苷酸酶和血清實驗證明,MLDH能夠保護(hù)DNA。MTT細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示MLDH對A549、SGC-7901和SKOV3三種不同株系的細(xì)胞增殖活性有一定影響,并對細(xì)胞的增殖抑制作
6、用存在一定的劑量、時間依賴性特征,細(xì)胞活性隨著MLDH濃度的增加而降低。
2.磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)的細(xì)胞傳輸過程研究
為了解MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)化過程,MLDH/DNA復(fù)合物干預(yù)SGC-7901細(xì)胞,通過體外細(xì)胞吞噬鐵染色實驗方法,采用普通的倒置顯微鏡宏觀觀察了鐵染色陽性細(xì)胞;透射電鏡進(jìn)一步跟蹤了MLDH/DNA復(fù)合物在亞細(xì)胞器中的分布特點;用YOYO-1核酸染料標(biāo)記MLDH/DNA復(fù)
7、合物,激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究了細(xì)胞的吞噬過程。結(jié)果表明:MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物能夠隨時間的推移,被細(xì)胞吞噬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),最終將DNA成功轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核。
3.磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)的體內(nèi)磁靶向轉(zhuǎn)運效果
用近紅外染料標(biāo)記基因運載系統(tǒng)、制成MLDH-DNA/Nucleic Acid Labeling復(fù)合物,以昆明小鼠為實驗動物,通過活體成像技術(shù)考察了MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物在小鼠體內(nèi)的實時分布
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