林生地霉培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)觀察及生理學(xué)實(shí)驗(yàn).pdf

1、目的： 林生地霉(Geotrichum sivicola)是新近發(fā)現(xiàn)的地霉屬的一個(gè)種，較為罕見(jiàn)。2002年從我科1例膿癬患兒的皮損中分離得到一株林生地霉，首次發(fā)現(xiàn)該菌可感染人類(lèi)。2005年，我科又自1例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離出一株林生地霉。朱敬先等對(duì)該血液分離株進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)觀察。 本研究一方面通過(guò)對(duì)林生地霉血液分離株在五種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)情況進(jìn)行觀察，以便尋找出更適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；另一方面，通過(guò)一

2、些常規(guī)的生理學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步了解林生地霉的一些生理學(xué)特征，為實(shí)驗(yàn)室的鑒定工作提供幫助，對(duì)臨床林生地霉感染的診斷具有重要意義。 方法： 1 五種培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察1．1平皿培養(yǎng)的大體菌落觀察取林生地霉血液株置常溫下復(fù)蘇，3天后轉(zhuǎn)種于沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽汁瓊脂(MEA)、玉米粉瓊脂(CMA)和察氏瓊脂(CZA)平皿培養(yǎng)基上，分別置37℃和27℃溫箱培養(yǎng)2周，每日測(cè)量并記錄菌落直徑，觀察菌

3、落形態(tài)，最后以生長(zhǎng)時(shí)間和菌落平均直徑繪成生長(zhǎng)曲線。 1．2平皿培養(yǎng)的光鏡下觀察每日分別挑取37℃和27℃的五種培養(yǎng)基的菌落標(biāo)本置于載玻片上，經(jīng)乳酸酚棉藍(lán)染色，光鏡下觀察。 1．3小培養(yǎng)(鋼圈法)將林生地霉血液株分別點(diǎn)種于以上五種培養(yǎng)基的小培養(yǎng)上，37℃和27℃溫箱培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢情況，共2周。 2生理學(xué)實(shí)驗(yàn) 2．1芽管試驗(yàn)挑取菌落置于0.5ml人血清中，置37℃溫箱孵育3h，觀察是否有芽管形成

4、。 2．2厚膜孢子試驗(yàn)將試驗(yàn)菌株接種于玉米-吐溫80瓊脂培養(yǎng)基上，室溫孵育24-72小時(shí)，觀察厚膜孢子形成情況。 2．3硝酸鹽同化試驗(yàn)將菌落配置成菌懸液，加入到無(wú)氮源培養(yǎng)基中，分別加少量硝酸鉀及蛋白胨于培養(yǎng)基表面。室溫培養(yǎng)，每日觀察。 2．4放線菌酮耐受試驗(yàn)將菌落配置成菌懸液，分別接種于含有放線菌酮和不含放線菌酮的沙氏瓊脂培養(yǎng)基上。室溫培養(yǎng)3天，觀察結(jié)果。 2．5尿素酶試驗(yàn)將菌落接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基上，室

5、溫培養(yǎng)1周，觀察培養(yǎng)基變色情況。 2．6糖發(fā)酵試驗(yàn)將菌落接種于含有杜氏管的各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃孵育，每日觀察發(fā)酵情況。 2．7API 20C酵母系統(tǒng)利用API 20C AUX試劑盒檢測(cè)，判讀反應(yīng)結(jié)果，將結(jié)果編號(hào)對(duì)照API 20CAUX編碼冊(cè)，待結(jié)果。 結(jié)果： 1五種培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察1．1平皿培養(yǎng)的大體菌落觀察1．1．1繪制的生長(zhǎng)曲線在SDA、PDA和MEA三種培養(yǎng)基上，林生地霉于培養(yǎng)的第1周生長(zhǎng)

6、較快，其生長(zhǎng)速度與時(shí)間呈正比；在兩種溫度下，27℃較37℃生長(zhǎng)快。在CMA和CZA兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度始終較慢，27℃較37℃生長(zhǎng)稍快。 1．1．2菌落直徑同種培養(yǎng)基在不同溫度下其菌落直徑的比較結(jié)果顯示，于生長(zhǎng)7天和14天時(shí)，各培養(yǎng)基在27℃的菌落直徑均比37℃菌落直徑大，有顯著性差異。 27℃，不同培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)第1天、7天和14天時(shí)，菌落直徑均以PDA最大，SDA、MEA次之，CZA最小，除第1天時(shí)PDA與SDA菌落差異無(wú)顯

7、著性，其余各培養(yǎng)基之間均有顯著性差異。 37℃，不同培養(yǎng)基上，第1天、7天和14天時(shí)，PDA．上菌落直徑最大，MEA、SDA次之，CZA的菌落直徑最小，除第14天時(shí)PDA與MEA菌落差異無(wú)顯著性，其余各培養(yǎng)基之間均有顯著性差異。 1．1.3大體菌落形態(tài)觀察培養(yǎng)第1天時(shí)即可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，初為白色粉末狀、絨毛樣、膜樣，表面平坦，常干燥，后逐漸變?yōu)闈駶?rùn)、有粘性的類(lèi)酵母樣菌落。 1．2平皿培養(yǎng)的光鏡下觀察27℃：可見(jiàn)大量的

8、矩形、桶形關(guān)節(jié)孢子，大小不一，圓形、橢圓形小分生孢子和較多的出芽、芽管，可見(jiàn)厚膜孢子，較多的分支、分隔菌絲。 37℃：可見(jiàn)較多的矩形關(guān)節(jié)孢子，厚膜孢子、出芽及芽管均少于27℃，菌絲較少。 1．3小培養(yǎng)(鋼圈法)27℃，SDA：大量的分支、分隔菌絲和豐富的矩形、橢圓形關(guān)節(jié)孢子，出芽及芽管較多，芽管延伸形成短的關(guān)節(jié)菌絲，很快斷裂為關(guān)節(jié)孢子。PDA：生長(zhǎng)情況基本同SDA。MEA：大量的關(guān)節(jié)菌絲和矩形關(guān)節(jié)孢子，出芽、芽管較多見(jiàn)。

9、CMA：較多的細(xì)分隔菌絲，散在成堆或3-5個(gè)連在一起的矩形、橢圓形孢子，出芽不多見(jiàn)。CZA：基本同CMA，但菌絲較細(xì)。 37℃，SDA：較多矩形、橢圓形關(guān)節(jié)孢子及圓形小分生孢子，逐漸增多的出芽孢子，可見(jiàn)多邊出芽，芽管亦多見(jiàn)，菌絲稀少，二叉或三叉分支。PDA：基本同SDA，芽生孢子及芽管較SDA稍多。MEA：較多的關(guān)節(jié)菌絲和矩形關(guān)節(jié)孢子，可見(jiàn)出芽孢子及芽管。CMA：較多的細(xì)分支分隔菌絲，出芽及芽管較27℃少。 CZA：芽管及出芽少于CMA

10、。 2 生理學(xué)實(shí)驗(yàn)2．1 芽管試驗(yàn)陰性2．2 厚膜孢子試驗(yàn)陽(yáng)性2．3 硝酸鹽同化試驗(yàn)陰性2．4 放線菌酮耐受試驗(yàn)陽(yáng)性2．5 尿素酶試驗(yàn)弱陽(yáng)性2．6 糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性2．7 API 20C AUX試劑盒檢測(cè)對(duì)照法國(guó)生物梅里埃公司的API 20CAUX編碼冊(cè)，提示該菌為帚狀地霉。其中葡萄糖、甘油、木糖、山梨醇均為陽(yáng)性；2-酮基-葡萄糖酸鹽、阿拉伯糖、阿東醇、木糖醇、半乳糖、肌醇、a-甲基-D-葡萄糖、N-乙酰-葡萄糖甙、纖維二糖、乳糖