Riccardin D靶向DNA拓撲異構酶Ⅱ的抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：拓撲異構酶是一種真核生物生存所必需的核酶，可介導DNA單鏈或雙鏈的瞬時斷裂和再連接，在DNA復制、轉錄、重組及染色體分離等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。根據其誘導DNA斷裂方式的不同，分為拓撲異構酶Ⅰ和拓撲異構酶Ⅱ，以拓撲異構酶為靶點的抗癌作用成為化療藥物研究的一個重要方向。臨床上許多一抗腫瘤藥物以拓撲異構酶為作用靶點，取得了一定臨床療效。但在應用過程中仍出現一些問題：多藥耐藥性的產生，因長期使用拓撲異構酶毒劑而出現的繼發(fā)性急性髓樣白血病

2、以及心臟毒性。因此，開發(fā)安全，高效，低毒以及可逆轉多藥耐藥的以拓撲異構酶為靶點的化療藥物意義重大。RiccardinD是從苔蘚類植物Dumortiera hirsuta分離所得的一種新型的大環(huán)雙聯卞類化合物。前期研究表明，RiccardinD可以抑制真菌被膜的形成，它的類似物羽苔素E可以逆轉真菌耐藥和腫瘤耐藥，另一類似物地錢素C可以通過誘導微管解聚進而導致細胞凋亡最終發(fā)揮抗腫瘤作用，還可將腫瘤細胞阻滯在G2/M期抑制其增殖。本研究是基于

3、前期研究結果推測RiccardinD可能會具有抗腫瘤及逆轉多藥耐藥作用。
　　 方法：⑴選用人慢性骨髓性白血病細胞株K562及人急性粒細胞白血病細胞株HL60，MTT法檢測不同濃度riccardinD對白血病細胞增殖的抑制作用，Hoechst33258，FITC-AnnexinⅤ雙染法及DNA Ladder檢測riccardinD對白血病細胞凋亡的影響。Western blotting檢測riccardinD對凋亡蛋白Caspa

4、se-3，Caspase-9，cleaved PARP表達的影響。RT-PCR檢測riccardinD對細胞凋亡抑制因子Bcl-2與細胞凋亡促進因子Bax-α比值的影響。最后檢測線粒體和死亡受體介導的兩條凋亡通路中的關鍵分子Cytochrome c及Caspase-8分析riccardinD可能介導的凋亡通路。⑵以pBR322 DNA為作用底物，etoposide為陽性對照，檢測riccardinD對拓撲異構酶Ⅰ和拓撲異構酶Ⅱ活性的影響

5、。將riccardinD作用于K562細胞后，提取其拓撲異構酶Ⅱ，檢測riccardinD對細胞內拓撲異構酶Ⅱ活性的影響。實時定量RT-PCR檢測riecardin D對DNA拓撲異構酶Ⅱα基因表達的影響。SPR分析進一步檢測riccardinD與拓撲異構酶Ⅱα間的結合能力。選用拓撲異構酶Ⅱα缺陷型細胞株HL60/MX2及構建拓撲異構酶Ⅱα高表達細胞系K562/TopoⅡα檢測riccaxdinD對兩種細胞增殖的影響。⑶體外法，選取非小

6、細胞肺癌細胞H460及A549，采用MIT，Hoechst33258及FITC-AnnexinⅤ雙染法檢測riccardinD對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響。另外，劃痕試驗、重組基底膜侵襲與轉移及明膠酶活性測定試驗檢測riccardinD對非小細胞肺癌細胞侵襲及轉移能力的影響。體內法，以H460細胞接種裸鼠腋下，待腫瘤長至100mm3-300mm3開始尾靜脈注射給予riccardinD，三天一次，給藥三周。給藥結束后，取瘤組織稱重，計算抑

7、瘤率。取瘤塊進行Western blotting及TUNEL試驗檢測riccardinD體內抑瘤作用及對腫瘤組織內凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9，cleaved PARP及侵襲轉移相關蛋白MMP-2，MMP-9，VEGF及Erk1/2的影響。⑷選用兩株耐藥株K562/A02及H460/RT，分別是阿霉素和紫杉醇耐藥株。采用MTT法檢測riccardinD單用，阿霉素與riccardinD合用，紫杉醇和riccardinD

8、合用后對耐藥細胞的抑制作用，計算合用后藥物逆轉倍數。以逆轉作用較強的紫杉醇和riccardinD合用組進行裸鼠試驗，以H460/RT細胞接種裸鼠腋下，待腫瘤生長至100mm3-300mm3時給予riccardinD和紫杉醇。給藥結束，取瘤組織稱重，計算抑瘤率。取瘤組織檢測凋亡蛋白及耐藥蛋白表達。另外，檢測riccardinD對K562/A02細胞凋亡蛋白，耐藥蛋白及基因表達水平的影響。
　　 結果：①MTT結果顯示，以ricca

9、rdin D(10μM-60μM)分別與K562，HL60細胞孵育24h，48h，72h，最高抑制率90.6％。Hoechst33258結果顯示，10μM，20μM和30μM riccardin D明顯誘導細胞凋亡，孵育48h，細胞核染色質濃染，固縮或集聚核膜周邊、或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinⅤ雙染結果顯示，10μM riccardinD處理K562細胞24h凋亡率為25.55％，HL60凋亡率為27.56％。DNA La

10、dder結果顯示，riccardin D處理后產生明顯DNA梯狀片段。Western blot結果顯示，10μM-40μM riccardin D顯著增加K562和HL60細胞的Caspaso-3，Caspaso-9，cleaved PARP蛋白表達水平。RT-PCR顯示，riccardin D可顯著降低Bcl-2 mRNA水平，增加Bax-α mRNA水平，8cl-2/Bax-α比值明顯降低。此外，10μM-40μMriccardin

11、 D可顯著增加K562細胞內Cytochrome c釋放，而對procaspase-8蛋白表達水平無明顯影響。②拓撲異構酶活性檢測顯示，riccardin D對拓撲異構酶Ⅰ活性無明顯影響，而200μM-800μM riccardin D體外可明顯抑制拓撲異構酶Ⅱ活性，呈現濃度劑量依賴關系，而且riccardin D對拓撲異構酶Ⅱ活性的抑制作用明顯強于陽性對照etoposide。Riccardin D孵育后的K562細胞內拓撲異構酶Ⅱ活性

12、顯著降低。實時定量RToPCR檢測結果表明，riccardin D顯著降低K562細胞內DNA拓撲異構酶Ⅱα mRNA水平。以SPR技術分析顯示，riccardin D與拓撲異構酶Ⅱ高度結合，結合常數KD為2.68E-06。進一步實驗，riccardin D對高表達拓撲異構酶Ⅱ細胞抑制作用顯著，而對拓撲異構酶Ⅱ缺陷型細胞株HL60/MX2抑制作用較弱，說明riccardin D可能通過靶向拓撲異構酶Ⅱ產生抗癌作用。③MTT，Hoechs

13、t33258，FITC-AnnexinⅤ雙染及Western blot試驗結果均顯示，riccardin D顯著抑制非小細胞肺癌細胞增殖，促進細胞凋亡及增加凋亡蛋白表達水平。劃痕試驗結果表明，51μM-10μM riccardin D抑制A549細胞向無細胞劃痕區(qū)遷移。Transwell侵襲試驗顯示，riccardin D抑制A549細胞穿透人工基底膜，當riccardin D濃度為5μM，10μM，20μM時，抑制率分別為40.7％，

14、56.5％，65.4％。明膠酶譜結果顯示，2.51μM，5μM，10μM riccardin D顯著抑制A549和H460細胞培養(yǎng)液中MMP-2，MMP-9活性。裸鼠移植瘤試驗顯示，riccardinD明顯抑制腫瘤組織生長，20mg/kg時抑制率為44.5％，且裸鼠體重下降不明顯。進一步檢查腫瘤組織，顯示TUNEL陽性染色水平增加，凋亡率為36.9％。④以10μM dccardin D與阿霉素聯合處理K562/A02可逆轉阿霉素耐藥，其

15、逆轉倍數為2.31。以10μM riccardin D與紫杉醇聯合處理H460/RT可逆轉紫杉醇耐藥，逆轉倍數為8.42。Riccardin D與紫杉醇聯合處理接種H460/RT的裸鼠，riccardinD，紫杉醇單用組抑瘤率分別為46.8％和48.1％。而riccardin D與紫杉醇合用組腫瘤抑制率為57.3％.與單用組比較，合用組較單用組抑瘤率升高，且凋亡蛋白表達水平明顯升高，而耐藥蛋白表達水平顯著降低。電泳結果顯示，riccar