Riccardin D靶向DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種真核生物生存所必需的核酶，可介導(dǎo)DNA單鏈或雙鏈的瞬時(shí)斷裂和再連接，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及染色體分離等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。根據(jù)其誘導(dǎo)DNA斷裂方式的不同，分為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，以拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶點(diǎn)的抗癌作用成為化療藥物研究的一個(gè)重要方向。臨床上許多一抗腫瘤藥物以拓?fù)洚悩?gòu)酶為作用靶點(diǎn)，取得了一定臨床療效。但在應(yīng)用過程中仍出現(xiàn)一些問題：多藥耐藥性的產(chǎn)生，因長期使用拓?fù)洚悩?gòu)酶毒劑而出現(xiàn)的繼發(fā)性急性髓樣白血病

2、以及心臟毒性。因此，開發(fā)安全，高效，低毒以及可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的以拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶點(diǎn)的化療藥物意義重大。RiccardinD是從苔蘚類植物Dumortiera hirsuta分離所得的一種新型的大環(huán)雙聯(lián)卞類化合物。前期研究表明，RiccardinD可以抑制真菌被膜的形成，它的類似物羽苔素E可以逆轉(zhuǎn)真菌耐藥和腫瘤耐藥，另一類似物地錢素C可以通過誘導(dǎo)微管解聚進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡最終發(fā)揮抗腫瘤作用，還可將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期抑制其增殖。本研究是基于

3、前期研究結(jié)果推測(cè)RiccardinD可能會(huì)具有抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。
　　 方法：⑴選用人慢性骨髓性白血病細(xì)胞株K562及人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60，MTT法檢測(cè)不同濃度riccardinD對(duì)白血病細(xì)胞增殖的抑制作用，Hoechst33258，F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ雙染法及DNA Ladder檢測(cè)riccardinD對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的影響。Western blotting檢測(cè)riccardinD對(duì)凋亡蛋白Caspa

4、se-3，Caspase-9，cleaved PARP表達(dá)的影響。RT-PCR檢測(cè)riccardinD對(duì)細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2與細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子Bax-α比值的影響。最后檢測(cè)線粒體和死亡受體介導(dǎo)的兩條凋亡通路中的關(guān)鍵分子Cytochrome c及Caspase-8分析riccardinD可能介導(dǎo)的凋亡通路。⑵以pBR322 DNA為作用底物，etoposide為陽性對(duì)照，檢測(cè)riccardinD對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性的影響

5、。將riccardinD作用于K562細(xì)胞后，提取其拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，檢測(cè)riccardinD對(duì)細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性的影響。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)riecardin D對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα基因表達(dá)的影響。SPR分析進(jìn)一步檢測(cè)riccardinD與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα間的結(jié)合能力。選用拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα缺陷型細(xì)胞株HL60/MX2及構(gòu)建拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα高表達(dá)細(xì)胞系K562/TopoⅡα檢測(cè)riccaxdinD對(duì)兩種細(xì)胞增殖的影響。⑶體外法，選取非小

6、細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460及A549，采用MIT，Hoechst33258及FITC-AnnexinⅤ雙染法檢測(cè)riccardinD對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響。另外，劃痕試驗(yàn)、重組基底膜侵襲與轉(zhuǎn)移及明膠酶活性測(cè)定試驗(yàn)檢測(cè)riccardinD對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。體內(nèi)法，以H460細(xì)胞接種裸鼠腋下，待腫瘤長至100mm3-300mm3開始尾靜脈注射給予riccardinD，三天一次，給藥三周。給藥結(jié)束后，取瘤組織稱重，計(jì)算抑

7、瘤率。取瘤塊進(jìn)行Western blotting及TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)riccardinD體內(nèi)抑瘤作用及對(duì)腫瘤組織內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9，cleaved PARP及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2，MMP-9，VEGF及Erk1/2的影響。⑷選用兩株耐藥株K562/A02及H460/RT，分別是阿霉素和紫杉醇耐藥株。采用MTT法檢測(cè)riccardinD單用，阿霉素與riccardinD合用，紫杉醇和riccardinD

8、合用后對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制作用，計(jì)算合用后藥物逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。以逆轉(zhuǎn)作用較強(qiáng)的紫杉醇和riccardinD合用組進(jìn)行裸鼠試驗(yàn)，以H460/RT細(xì)胞接種裸鼠腋下，待腫瘤生長至100mm3-300mm3時(shí)給予riccardinD和紫杉醇。給藥結(jié)束，取瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。取瘤組織檢測(cè)凋亡蛋白及耐藥蛋白表達(dá)。另外，檢測(cè)riccardinD對(duì)K562/A02細(xì)胞凋亡蛋白，耐藥蛋白及基因表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：①M(fèi)TT結(jié)果顯示，以ricca

9、rdin D(10μM-60μM)分別與K562，HL60細(xì)胞孵育24h，48h，72h，最高抑制率90.6％。Hoechst33258結(jié)果顯示，10μM，20μM和30μM riccardin D明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，孵育48h，細(xì)胞核染色質(zhì)濃染，固縮或集聚核膜周邊、或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinⅤ雙染結(jié)果顯示，10μM riccardinD處理K562細(xì)胞24h凋亡率為25.55％，HL60凋亡率為27.56％。DNA La

10、dder結(jié)果顯示，riccardin D處理后產(chǎn)生明顯DNA梯狀片段。Western blot結(jié)果顯示，10μM-40μM riccardin D顯著增加K562和HL60細(xì)胞的Caspaso-3，Caspaso-9，cleaved PARP蛋白表達(dá)水平。RT-PCR顯示，riccardin D可顯著降低Bcl-2 mRNA水平，增加Bax-α mRNA水平，8cl-2/Bax-α比值明顯降低。此外，10μM-40μMriccardin

11、 D可顯著增加K562細(xì)胞內(nèi)Cytochrome c釋放，而對(duì)procaspase-8蛋白表達(dá)水平無明顯影響。②拓?fù)洚悩?gòu)酶活性檢測(cè)顯示，riccardin D對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ活性無明顯影響，而200μM-800μM riccardin D體外可明顯抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，呈現(xiàn)濃度劑量依賴關(guān)系，而且riccardin D對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性的抑制作用明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照etoposide。Riccardin D孵育后的K562細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性

12、顯著降低。實(shí)時(shí)定量RToPCR檢測(cè)結(jié)果表明，riccardin D顯著降低K562細(xì)胞內(nèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα mRNA水平。以SPR技術(shù)分析顯示，riccardin D與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ高度結(jié)合，結(jié)合常數(shù)KD為2.68E-06。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，riccardin D對(duì)高表達(dá)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ細(xì)胞抑制作用顯著，而對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ缺陷型細(xì)胞株HL60/MX2抑制作用較弱，說明riccardin D可能通過靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ產(chǎn)生抗癌作用。③MTT，Hoechs

13、t33258，F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ雙染及Western blot試驗(yàn)結(jié)果均顯示，riccardin D顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及增加凋亡蛋白表達(dá)水平。劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明，51μM-10μM riccardin D抑制A549細(xì)胞向無細(xì)胞劃痕區(qū)遷移。Transwell侵襲試驗(yàn)顯示，riccardin D抑制A549細(xì)胞穿透人工基底膜，當(dāng)riccardin D濃度為5μM，10μM，20μM時(shí)，抑制率分別為40.7％，

14、56.5％，65.4％。明膠酶譜結(jié)果顯示，2.51μM，5μM，10μM riccardin D顯著抑制A549和H460細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2，MMP-9活性。裸鼠移植瘤試驗(yàn)顯示，riccardinD明顯抑制腫瘤組織生長，20mg/kg時(shí)抑制率為44.5％，且裸鼠體重下降不明顯。進(jìn)一步檢查腫瘤組織，顯示TUNEL陽性染色水平增加，凋亡率為36.9％。④以10μM dccardin D與阿霉素聯(lián)合處理K562/A02可逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥，其

15、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.31。以10μM riccardin D與紫杉醇聯(lián)合處理H460/RT可逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.42。Riccardin D與紫杉醇聯(lián)合處理接種H460/RT的裸鼠，riccardinD，紫杉醇單用組抑瘤率分別為46.8％和48.1％。而riccardin D與紫杉醇合用組腫瘤抑制率為57.3％.與單用組比較，合用組較單用組抑瘤率升高，且凋亡蛋白表達(dá)水平明顯升高，而耐藥蛋白表達(dá)水平顯著降低。電泳結(jié)果顯示，riccar