鈣離子對(duì)高基質(zhì)金屬蛋白酶-9狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景:
　　心室重構(gòu)(ventricular remodeling)是多種心血管疾病心臟功能由代償向失代償轉(zhuǎn)變的重要病理生理基礎(chǔ)。探討心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,從而阻逆心室重構(gòu)的發(fā)生,對(duì)改善心血管病患者預(yù)后具有重要的意義。
　　心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix,ECM)重構(gòu),前者為心肌細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)、代謝及功能異常改變,后者主要是指心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts,

2、CFs)增殖和膠原網(wǎng)絡(luò)的含量及組成發(fā)生改變?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組內(nèi)源性蛋白酶的家族,存在于多種組織中,并具有降解細(xì)胞外基質(zhì)等功能。近年研究發(fā)現(xiàn),心肌組織中也存在多種MMP,其中MMP-9是心肌組織中含量較高的MMP。既往研究顯示,一些心血管疾病演變過(guò)程中存在MMP-9表達(dá)增高,同時(shí)伴有心肌ECM成分發(fā)生變化、心肌纖維化、室壁順應(yīng)性降低、心功能異常等心室重構(gòu)表現(xiàn)。例如:心肌梗

3、死后心肌組織中MMP-9表達(dá)升高,左心室擴(kuò)大,敲除MMP-9基因后心室擴(kuò)大改善。Chua等研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織中MMP-9表達(dá)升高,心肌纖維化明顯,心肌收縮力下降?？梢?jiàn)MMP-9表達(dá)增高與某些心血管疾病心室重構(gòu)可能有密切關(guān)系。另一方面,有研究顯示,鈣離子對(duì)多種組織MMP-9的表達(dá)和組織重構(gòu)存在影響,例如:Jiang等發(fā)現(xiàn)增加肝癌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流能促進(jìn)其MMP-9的釋放與激活;Hwang等發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用鈣離子螯合劑減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣

4、離子能抑制MMP-9的分泌;Shen X.C.等對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型研究發(fā)現(xiàn),用藏紅花素使心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子減少,能降低心肌細(xì)胞MMP-9表達(dá)并改善心室重構(gòu);楊永健等在心肌梗死大鼠模型中使用鈣離子通道阻滯劑阿莫地平和米貝拉地爾,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種鈣離子通道阻滯劑均能抑制心肌組織MMP-9的表達(dá),減少細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白的降解,改善心室重構(gòu)等等。心肌成纖維細(xì)胞作為心肌間質(zhì)中的主要細(xì)胞(占心肌間質(zhì)細(xì)胞90％以上),能合成和分泌多種

5、活性物質(zhì),調(diào)節(jié)膠原含量,在心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)中占重要地位。然而,鈣離子能否對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的MMP-9表達(dá)、成纖維細(xì)胞增殖和膠原代謝產(chǎn)生同樣的影響卻少見(jiàn)報(bào)道。鈣離子作為機(jī)體的一種電解質(zhì)存在于多種組織,包括心肌組織。在一些心血管疾病,如,心肌梗死、高血壓、心肌病等,往往存在心肌組織高M(jìn)MP-9狀態(tài)和高鈣狀態(tài)(例如,缺血再灌注、炎癥等可造成局部鈣超負(fù)荷)。因此研究在高M(jìn)MP-9狀態(tài)下,鈣離子對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的MMP-9表達(dá)、成纖維細(xì)胞增殖和

6、膠原代謝、對(duì)MMP-9活性的影響,將有助于進(jìn)一步闡明某些心血管疾病狀態(tài)下心室重構(gòu)機(jī)制及尋求新的治療靶點(diǎn)。
　　目的:
　　探討不同細(xì)胞鈣離子濃度對(duì)高M(jìn)MP-9狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制,為進(jìn)一步闡明心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù),同時(shí)為心室重構(gòu)尋求新的治療途徑。
　　材料與方法:
　　1.MMP-9、氯化鈣(CaCL2)以及MMP-9+CaCL2對(duì)心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖影響的研究
　　將2-3

7、代的wistar大鼠乳鼠心肌成纖維細(xì)胞(CFs)以1×106/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板,按以下方式分組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,加入相應(yīng)培養(yǎng)液孵育24小時(shí)后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。具體分組如下:
　　1.1、MMP-9對(duì)CFs增殖影響的研究
　　分為:
　?、賹?duì)照組(加入單純培養(yǎng)液10μl);
　?、?0nM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為40nmol/L的

8、培養(yǎng)液10μl);
　?、?00nM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?μM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為1μmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?μM MMP-9組(加入MMP-9終濃度為5μmol/L的培養(yǎng)液10μl)。
　　1.2、CaCL2對(duì)CFs增殖影響的研究
　　分為:
　　①對(duì)照組(加入單純培養(yǎng)液10μl);
　?、?.2

9、mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.2mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?.4mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　　④0.8mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液10μl)。
　　1.3、MMP-9+CaCL2對(duì)CFs增殖影響的研究
　　分為:
　　①對(duì)照組(加入單純培養(yǎng)液10μl);
　?、谀Ｐ徒M(加入MM

10、P-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?.2mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.2mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　?、?.4mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液10μl);
　　⑤0.8mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol

11、/L、CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液10μl)。
　　2.不同Ca2+濃度對(duì)高M(jìn)MP-9狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞MMP-9和膠原表達(dá)影響的研究
　　從以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇200nmol/L的MMP-9為高M(jìn)MP-9狀態(tài),建立高M(jìn)MP-9狀態(tài)模型。將心肌成纖維細(xì)胞(CFs)接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞密度為1×106個(gè)/瓶。貼壁后換無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后分為:
　?、賹?duì)照組(加入單純

12、培養(yǎng)液5ml);
　?、阝}離子螯合劑(BAPTA-AM)組(加入BAPTA-AM終濃度為10μmol/L、MMP-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　?、勰Ｐ徒M:(加入MMP-9終濃度為200nmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　?、?.2mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.2mmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　　⑤0.4mM CaCL2+MMP

13、-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　?、?.8mM CaCL2+MMP-9組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液5ml);
　　⑦維拉帕米組(加入MMP-9終濃度為200nmol/L、CaCL2終濃度為0.8mmol/L、維拉帕米終濃度為50μmol/L的培養(yǎng)液5ml)。
　　孵育24小時(shí)后,提取

14、細(xì)胞蛋白和RNA,用免疫印跡法(western blotting)檢測(cè)孵育物中MMP-9以及Ⅰ型(collagen I)、Ⅲ型膠原(collagen III)水平;QRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9mRNA和collagen I及collagen III mRNA的表達(dá)和用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　3.不同Ca2+濃度對(duì)MMP-9活性影響的研究
　　將MMP-9分成3組,每組MMP-9的量為1μg,加入不同

15、濃度的CaCL2相互作用30min后用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9的活性。分組情況如下:
　?、賹?duì)照組(加入單純培養(yǎng)液0.5ml);
　?、?.4mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.4mmol/L的培養(yǎng)液0.5ml);
　?、?.8mM CaCL2組(加入CaCL2終濃度為0.8mmol/L的培養(yǎng)液0.5ml)。
　　結(jié)果:
　　1.MMP-9對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響
　　隨著MMP-9濃度的

16、升高,從對(duì)照組、40nM MMP-9組、200nM MMP-9至1μM MMP-9組心肌成纖維細(xì)胞增殖依次升高,組間比較(p<0.05),但MMP-9濃度達(dá)到5μM時(shí)心肌成纖維細(xì)胞增殖較1μM MMP-9組低(p<0.05),與200nM MMP-9組相仿(p>0.05)。
　　2.不同Ca2+濃度對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響
　　不同CaCL2濃度組之間心肌成纖維細(xì)胞增殖情況無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　3.不同C

17、a2+濃度對(duì)高M(jìn)MP-9狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響
　　在高M(jìn)MP-9狀態(tài)下,加入不同濃度Ca2+后,隨著Ca2+濃度的升高,CFs增殖有逐漸升高的趨勢(shì),但僅當(dāng)Ca2+濃度為0.8mM時(shí)CFs增殖才明顯高于對(duì)照組(p<0.05)。
　　4.不同Ca2+濃度對(duì)心肌成纖維細(xì)胞MMP-9、collagen I、collagen III表達(dá)的影響。
　　4.1、不同Ca2+濃度對(duì)心肌成纖維細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響
　

18、　在高M(jìn)MP-9狀態(tài)下,隨著ca2+濃度升高,對(duì)照組、BAPTA-AM組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組至0.8mM CaCL2+MMP-9組的MMP-9mRNA表達(dá)依次增高,組間比較差異顯著(p<0.05),使用維拉帕米干預(yù)后,MMP-9mRNA表達(dá)明顯降低(與0.8mMCaCL2+MMP-9組比較p<0.01),與對(duì)照組相仿(p>0.05)。MMP-9蛋白表達(dá)從模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.4mM

19、CaCL2+MMP-9組至0.8mM CaCL2+MMP-9組依次增高,組間比較差異顯著(p<0.05)。使用BAPTA-AM干預(yù)后,MMP-9的表達(dá)降低(與模型組比較p<0.05),與對(duì)照組相近似(p>0.05)。使用維拉帕米干預(yù)后,MMP-9的表達(dá)降低(與0.8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.05),與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　4.2、不同Ca2+濃度對(duì)collagenI表達(dá)的影響
　　在高M(jìn)

20、MP-9狀態(tài)下,隨著Ca2+濃度升高,collagen I mRNA表達(dá)從對(duì)照組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.8mM CaCL2+MMP-9組表達(dá)依次增高,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),使用BAPTA-AM干預(yù)后,collagen I mRNA的表達(dá)降低(與模型組比較p<0.001)。使用維拉帕米干預(yù)后,collagen I mRNA的表達(dá)降低(與0.8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.001),并

21、低于對(duì)照組(p<0.001)。collagen I蛋白表達(dá)從對(duì)照組、BAPTA-AM組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.4mM CaCL2+MMP-9組、0.8mM CaCL2+MMP-9組逐漸降低,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),使用維拉帕米干預(yù)后,collagen I蛋白表達(dá)較0.8mM CaCL2+MMP-9組升高(p<0.01),但仍低于對(duì)照組(p<0.05)。
　　4.3、不同Ca2+濃度對(duì)col

22、lagen III表達(dá)的影響
　　在高M(jìn)MP-9狀態(tài)下,隨著Ca2+濃度升高,collagen III mRNA表達(dá)從對(duì)照組、模型組、0.2mM CaCL2+MMP-9組、0.8mM CaCL2+MMP-9組表達(dá)依次增高,組間比較有顯著差異(p<0.05),使用BAPTA-AM干預(yù)后,collagen III mRNA的表達(dá)降低(與模型組比較p<0.001)。使用維拉帕米干預(yù)后,collagen III mRNA的表達(dá)降低(與0.

23、8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.001),并低于對(duì)照組(p<0.001)。而各組collagen III蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組(p<0.05),組間比較無(wú)明顯差異(p>0.05)。使用維拉帕米干預(yù)后collagen III蛋白表達(dá)升高(與0.8mMCaCL2+MMP-9組比較p<0.05),但仍低于對(duì)照組(p<0.05)。
　　以上各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(以下用[Ca2+]i表示)的變化由模型組到0.8mM CaCL2+M

24、MP-9組依次升高,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05);模型組與對(duì)照組相仿(p>0.05)。使用BAPTA-AM干預(yù)后,[Ca2+]i降低(與模型組比較p<0.05)。使用維拉帕米干預(yù)后,[Ca2+]i降低(與0.8mM CaCL2+MMP-9組比較p<0.001),并與對(duì)照組相仿(p>0.05)。
　　5.[Ca2+]i與MMP-9表達(dá)水平的相關(guān)性分析
　　[Ca2+]i與MMP-9蛋白水平呈正相關(guān)(r=0.884p<0

25、.001),與MMP-9mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.950P<0.001))。
　　6.[Ca2+]i和MMP-9與Ⅰ、Ⅲ型膠原的相關(guān)性分析
　　[Ca2+]i與Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.698p<0.001)與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.913p<0.001);MMP-9與Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.841p<0.001)與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.942p<0.001);偏相關(guān)分

26、析顯示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i與Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.599p<0.01)與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.512p<0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9與Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.796p<0.001);MMP-9與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.707p<0.001)。
　　[Ca2+]i與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.733p<0.001)與Ⅲ型膠原

27、蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721p<0.001);MMP-9與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.868p<0.001)與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.707p<0.001);偏相關(guān)分析顯示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.599p<0.01)與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)(r=-0.290p>0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0

28、.812p<0.001)與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)(r=-0.215p>0.05)。
　　[Ca2+]i與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.915p<0.001),MMP-9與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.942p<0.001)。偏相關(guān)分析顯示,在控制MMP-9因素后,[Ca2+]i與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.522p<0.05)。在控制[Ca2+]i因素后,MMP-9與Ⅰ/Ⅲ型膠原比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.72

29、2p<0.001)。
　　7.不同Ca2+濃度對(duì)MMP-9活性的影響
　　MMP-9的活性隨Ca2+濃度升高而降低,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.鈣離子能使高M(jìn)MP-9狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞增殖。
　　2.鈣離子能抑制MMP-9的活性。
　　3.鈣離子能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞MMP-9的合成與表達(dá),從而降解Ⅰ、Ⅲ型膠原,使Ⅰ/Ⅲ膠原比例降低。
　　4.鈣通道阻滯劑和鈣離