中藥現(xiàn)場、快速鑒別方法的建立——以金銀花為例.pdf

1、快速、簡便、現(xiàn)場化的分子鑒別方法一直是中藥分子鑒別的追求。金銀花為臨床常用大宗中藥材，在中藥方劑及中成藥中具有廣泛應(yīng)用。2010版《中國藥典》規(guī)定金銀花的唯一植物基原為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)。然而，之前各版《中國藥典》根據(jù)臨床療效、地區(qū)用藥習慣等，曾先后選定忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬、水忍冬等作為金銀花正品來源，由于形態(tài)學高度相似，民間混用情況非常普遍。同時因金銀花與同屬偽品尤其是山銀花品種形態(tài)

2、學及化學成分高度相似，使用傳統(tǒng)方法難以到達鑒別目的。因此急需建立快速準確的金銀花分子鑒別方法。
　　 雖然之前的研究者使用了ISSR、PCR-RFLP、DNA條形碼等技術(shù)從分子水平上鑒別金銀花及其偽品，但這些方法均達不到快速、鑒別鑒別的目的。也難以對金銀花混偽品及含金銀花中成藥進行鑒別。
　　 本研究建立了4種金銀花鑒別方法，探索了金銀花快速鑒別技術(shù)、現(xiàn)場技術(shù)及金銀花混雜品與含金銀花中成藥的鑒別，建立了快速、簡便的金銀花

3、分子鑒別方法。本論文主要包括以下5個方面的內(nèi)容:
　　 一、金銀花分子鑒別方法的建立和及應(yīng)用。
　　 1、金銀花EST-SSR分子鑒別方法的建立。
　　 本研究通過生物信息學手段對本實驗室保存的忍冬及其變種紅白忍冬EST序列進行分析，共獲得3705條忍冬EST-SSRs及2818條紅白忍冬EST-SSRs。通過同源比對，在忍冬及其變種中共篩選出87對重復(fù)次數(shù)具有差異的EST-SSR。選出15對堿基數(shù)差異大于6的E

4、ST-SSR進行驗證，選出了jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65等3對引物用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。
　　 2、金銀花PCR-RFLP分子鑒別方法的建立。
　　 通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)金銀花PsbA-TrnH序列190存在一個G/T變異位點，致使金銀花能被內(nèi)切酶HinfⅠ(G(^)ANTC)酶切而其偽品不能;金銀花TrnL-TrnF序列625存在一個C/A變異位點，致使金銀花能被內(nèi)切酶NlaⅣ(

5、GGNN(^)CC)酶切而其偽品不能。分別使用PsbA-TrnH通用引物及TrnL-TrnF對96份金銀花樣品及69份偽品樣品進行PCR擴增，使用HinfⅠ及NlaⅣ進行限制性內(nèi)切酶消化成功鑒別了金銀花及其偽品。
　　 3、金銀花位點特異性PCR鑒別方法的建立。
　　 通過金銀花TrnL-TrnF序列625 C/A變異位點設(shè)計位點特異性PCR引物，對84份金銀花基原植物及其市售飲片、偽品進行雙向位點特異性PCR擴增，退火

6、溫度為61℃時，正品均出現(xiàn)468 bp的條帶，紅腺忍冬、華南忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、水忍冬、金銀忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9個偽品均出現(xiàn)324 bp的條帶，單次PCR即可鑒別正品和偽品。
　　 4、金銀花環(huán)介導等溫擴增鑒別方法的建立。
　　 根據(jù)TrnL-TrnF序列625 C/A變異位點設(shè)計了環(huán)介導等溫擴增(LAMP)引物組，對21份金銀花類中藥及50份其他種屬物種進行LAMP鑒別。當設(shè)定孵育溫度為63

7、℃時，擴增完成加入SYBR GreenⅠ熒光染料時，金銀花類中藥均顯強烈熒光而其偽品顯出極弱熒光。當溫度為65℃時，能鑒別金銀花與其同時偽品。
　　 通過對比選出了位點特異性PCR及環(huán)介導等溫擴增用于金銀花的鑒別。
　　 使用金銀花位點特異性PCR技術(shù)構(gòu)建雙向位點特異性PCR組(LJ1 F、LJ1 R、L J2 F、LJ2 R)對金銀花摻偽品進行了鑒別。在正品中摻入5％以上偽品即可準確鑒別，此時金銀花出現(xiàn)765 bp及4

8、68 bp的條帶，偽品出現(xiàn)765 bp及324 bp條帶，摻偽品出現(xiàn)3條條帶。
　　 使用金銀花位點特異性PCR技術(shù)對復(fù)方魚腥草片、羚羊感冒片、銀翹解毒片等3個含金銀花生藥原粉的中成藥進行了鑒別，使用PCR-RFLP進行驗證，發(fā)現(xiàn)所檢測的3個市售中成藥中均含有金銀花與山銀花。對3個中成藥進行克隆測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方魚腥草片可能含金銀花及華南忍冬，羚羊感冒片可能含金銀花及紅腺忍冬，銀翹解毒片可能含金銀花、華南忍冬、灰氈毛忍冬及紅腺忍冬

9、。
　　 使用金銀花LAMP技術(shù)設(shè)計引物組DCC-F3、DCC-B3、DCC-FIP、DCC-BIP對金銀花毒性偽品斷腸草原植物及其水提液進行了鑒別，當加入羥基萘酚藍染料后63℃恒溫擴增1h后，斷腸草顯天藍色而金銀花類藥材顯藍紫色。
　　 二、中藥材DNA的快速提取。
　　 通過優(yōu)選0.5 M氫氧化鈉、1％ PVP和1％Triton X-100作為提取緩沖液，使用堿裂解法提取144個中藥材DNA，動物藥使用COⅠ

10、、植物藥使用PsbA-TrnH通用引物進行PCR擴增，其中123個中藥獲得了陽性擴增結(jié)果，擴增成功率為85.2％。
　　 使用堿裂解法提取DNA用于烏梢蛇、金錢白花蛇及金銀花鑒別。使用堿裂解法10 min提取DNA，用烏梢蛇鑒別引物、金錢白花鑒別蛇引物及本文建立的金銀花鑒別引物進行擴增，結(jié)果與原有DNA提取方法獲得的結(jié)果一致。
　　 三、PCR增強劑在金銀花鑒定中的使用分析。
　　 分別利用CTAB法和堿裂解法提

11、取的180個中藥材DNA樣品，在PCR反應(yīng)體系中使用0.5％BSA與與1％ PVP組合作為PCR增強劑，研究增強劑對通用引物ITS2、PsbA-TrnH、rbcL、matK、TrnL-TrnF片段PCR成功率的影響，發(fā)現(xiàn)0.5％BSA與與1％ PVP組合能顯著增加通用引物PCR成功率。能提高位點特異性PCR鑒別穩(wěn)定性，減少假陰性結(jié)果產(chǎn)生。
　　 四、金銀花快速鑒別體系的建立。
　　 使用堿裂解法提取金銀花真?zhèn)纹分兴幉?，設(shè)

12、計引物L J-RAPID-1F及LJ-RAPID-1R進行位點特異性PCR鑒別，調(diào)整PCR反應(yīng)程序為87℃預(yù)變性1 min;87℃變性0s，68℃5s進行30個循環(huán);加入熒光染料SYBR GreenⅠ紫外比色。能在26 min內(nèi)完成PCR反應(yīng)，整個鑒別過程費時不超過40 min。
　　 五、金銀花現(xiàn)場鑒別體系的建立。
　　 通過使用堿裂解法提取DNA，配制便攜的恒溫加熱槽、手持式電動研磨儀及紫外燈，初步構(gòu)建了金銀花現(xiàn)場鑒

13、別體系并成功用于金銀花毒性偽品斷腸草的現(xiàn)場鑒定。完成檢測所需時間為1.5 h。
　　 結(jié)論:
　　 通過建立金銀花位點特異性PCR及環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，使用堿裂解法提取DNA，PCR增強劑增加位點特異性PCR穩(wěn)定性，建立快速位點特異性PCR，本研究構(gòu)建了金銀花快速鑒別體系及金銀花現(xiàn)場鑒別體系。能在40 min內(nèi)完成金銀花的鑒別，在1.5 h內(nèi)不需要大型儀器現(xiàn)場鑒別金銀花毒性偽品。
　　 本研究首次嘗試了對金銀花摻

14、偽品的鑒別及3種含金銀花原粉的中成藥的鑒別，可檢測正品中5％以上的偽品摻入量。通過位點特異性PCR快速檢測含金銀花原粉的中成藥中金銀花的真?zhèn)吻闆r，其結(jié)果與PCR-RFLP以及克隆測序結(jié)果相符。
　　 本研究建立了中藥材DNA的堿裂解提取法，能在10 min時間內(nèi)獲得DNA模板用于擴增，研究了PCR增強劑對CTAB提取DNA及堿裂解法提取DNA的增強作用。有助于解決中藥材分子鑒別擴率低的問題。
　　 通過金銀花位點特異性P