TLR4在脊髓擠壓傷后的表達及作用.pdf

1、脊髓損傷(SpinalCordinjury，SCI)后神經(jīng)功能修復(fù)一直是醫(yī)學界極具挑戰(zhàn)性的難題。近年來由于建筑業(yè)和交通運輸業(yè)的高速發(fā)展，SCI發(fā)病率逐年增高。脊髓損傷常導(dǎo)致不同程度的肢體殘障，給患者、家庭和社會帶來極大痛苦及沉重經(jīng)濟負擔。因此研究脊髓損傷后的病理生理變化，進而探索促進脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的治療措施，減輕患者痛苦，提高其生活質(zhì)量，已成為急待解決的主要課題。隨著對脊髓損傷研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后包括兩階段病理變化

2、：一是原發(fā)性損傷，另一階段是由原發(fā)性損傷引起的繼發(fā)性損傷，而繼發(fā)性損傷的損傷范圍遠大于原發(fā)性損傷，加劇了脊髓損傷的范圍和程度。因此研究脊髓繼發(fā)性損傷的病理機制，以及發(fā)現(xiàn)減輕繼發(fā)性損傷的治療手段已成為神經(jīng)科學研究工作者一直致力追求的目標。
　　研究表明，繼發(fā)性損傷機理主要包括血管的破壞缺血、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性、自由基和脂質(zhì)過氧化等(Tator,1998)，其中，炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，但其產(chǎn)生機制還不完全清楚。

3、在SCI后，細胞損傷及毒性物質(zhì)可迅速誘發(fā)固有免疫應(yīng)答，而CNS內(nèi)固有的小膠質(zhì)細胞是固有免疫應(yīng)答的重要組成部分。小膠質(zhì)細胞靜息狀態(tài)下，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystemCNS)中起著監(jiān)視作用，脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞迅速被激活并發(fā)生明顯的形態(tài)變化，從靜息多分支樣轉(zhuǎn)變成活化的變形蟲樣(Kreutzberg,1996;LiuandHong,2003;Streitetal.,1988,1999)，小膠質(zhì)細胞被激活后能夠釋放許多

4、可溶性分子，并促進炎癥反應(yīng)，具有潛在的細胞毒性(如表1所示)。而且小膠質(zhì)細胞表面的分子在其激活后也發(fā)生顯著的變化(Graeberetal.,1988;OehmichenandGencic,1975)。其中2003年研究報道Toll樣受體(Tolllikereceptor,TLR)4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達在小膠質(zhì)細胞(Lehnardt,2003)，在CNS固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動中均扮演著重要角色，近年來的研究開始關(guān)注TLRs在脊髓

5、損傷中作用，但利用TLRs基因突變在體內(nèi)和體外實驗所得結(jié)論并不一致(Kigerl,2007;Lehnardt,etal.,2003;Schonberg,2007)，為了明確TLRs與SCI后繼發(fā)性損傷的關(guān)系，我們設(shè)計的試驗分為兩部分旨在研究脊髓損傷后TLR4在小膠質(zhì)細胞表達的變化，以及其在脊髓損傷中的作用。
　　第一部分研究了脊髓擠壓傷后各時間點小膠質(zhì)細胞TLR4的表達變化及其與損傷面積和免疫球蛋白G滲出范圍的關(guān)系。本實驗在成年雄

6、性SD大鼠建立T8節(jié)段脊髓擠壓傷模型；然后一半假手術(shù)對照組及擠壓傷組動物在手術(shù)后0h、3h、24h、72h和7d用4％多聚甲醛灌注固定，取以擠壓點為中心的2cm脊髓，冰凍切片后進行H-E染色和免疫熒光染色，分別觀察損傷面積的變化、Toll樣受體4(TLR4)表達和TLR4陽性小膠質(zhì)細胞的分布，以及與血漿免疫球蛋白G(IgG)滲出范圍的比較，并用IPP軟件計算各組的陽性數(shù)目。結(jié)果表明，脊髓損傷后TLR4主要表達在小膠質(zhì)細胞，在3h-24h

7、之間開始表達，傷后在72h達到高峰，7d時已經(jīng)顯著下降。陽性小膠質(zhì)細胞的分布與IgG滲出范圍一致。另外做一批假手術(shù)對照組及擠壓傷0h、3h、24h、72h和7d手術(shù)組，分別在各時間點進行麻醉、斷頭取材，提取總RNA，進行TLR4的RT-PCR及real-timePCR擴增，結(jié)果顯示在mRNA水平TLR4表達在3h與正常組沒有差異，在72h達到高峰，7d明顯下降。與H.E.染色顯示的脊髓損傷面積變化的時程相一致，提示大鼠脊髓擠壓傷模型中，

8、表達在脊髓小膠質(zhì)細胞上的TLR4可在脊髓繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分研究了TLRs在脊髓繼發(fā)性損傷中的作用。本實驗同樣采用16只成年雄性SD大鼠建立T8節(jié)段脊髓擠壓傷模型，并于擠壓傷后在脊髓損傷中心緩慢注射TLRs信號通路中的關(guān)鍵分子MyD88的抑制劑(MyD88inhibitorpeptide,MIP)5ul或緩慢注射對照肽(controlpeptide,CP)5ul，并分別用浸有5ulMIP和5ulCP的明膠海綿覆

9、蓋損傷區(qū)，每組各4只，在7d時用4％多聚甲醛灌注固定，取以擠壓點為中心的2cm脊髓，冰凍切片后進行H-E染色和免疫熒光染色。每組另4只在7d斷頭活取以擠壓傷為中心的2cm脊髓，進行制樣以作P-P38MAPK，IL-1，TNF-α及caspase-3的westernblot試驗。在整個試驗過程中，用BBB評分及beam-walking試驗觀察對照組于給藥組在行為學上的差別。結(jié)果顯示，與對照組相比，MIP組使得大鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)加快

10、，脊髓組織凋亡細胞減少。并且凋亡細胞減少的原因可能是MIP阻礙了炎性因子的產(chǎn)生，這提示TLRs參與了脊髓繼發(fā)性損傷，在早期阻礙TLRs信號通路能夠減輕繼發(fā)性損傷。
　　綜上所述，我們在蛋白水平及mRNA水平確定了大鼠脊髓擠壓傷后TLR4表達的時程變化，并且其與脊髓損傷面積的變化趨勢一致性提示小膠質(zhì)細胞可能通過TLR4途徑參與脊髓繼發(fā)性損傷，在給與TLRs信號通路的MIP后，脊髓損傷得到較快的修復(fù)。證實TLRs通過MyD88信號途徑