中國南方廣西壯族自治區(qū)血紅蛋白病的分子流行病學調(diào)查.pdf

1、背景與目的
　　 血紅蛋白病是一組常染色體隱性遺傳病,可分為地中海貧血和異常血紅蛋白兩類。地中海貧血的特征是珠蛋白肽鏈的合成減少；異常血紅蛋白表現(xiàn)為珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異常。
　　 本研究的主要目的是闡明血紅蛋白病在廣西地區(qū)的流行率以及不同基因型地貧共同遺傳的方式。我們采用基因型和血液學表型相結(jié)合的分析方法,系統(tǒng)分析了來自廣西6個地區(qū)5789份樣本的α-、β-和δ-珠蛋白基因,確定了血紅蛋白病在廣西地區(qū)的攜帶率和突變譜,并評估

2、了血紅蛋白病在廣西不同地區(qū)與民族中的分布特點。此外,檢測過程中,我們首次發(fā)現(xiàn)并報道了6例α-或δ-地貧新突變,以及2例在中國首次報道的δ-珠蛋白基因突變。
　　 材料與方法
　　 1.人群樣本:根據(jù)廣西地區(qū)人口分布及民族構(gòu)成,共采集了廣西6個地區(qū)中12所中小學校的5789例廣西籍中小學生(男2841,女2948)的外周血樣本。漢族、壯族和瑤族樣本數(shù)的比例分別為58.1％、28.8％和10.7％,其它少數(shù)民族樣本占總樣本數(shù)

3、的2。4％。
　　 2.血液學分析:對所有樣本進行了血常規(guī)和血紅蛋白組成分析。根據(jù)血液學指標分析結(jié)果,進一步篩查標準型α-地貧、β-地貧、δ-地貧和異常血紅蛋白的基因型。進行標準型α-地貧分子篩查的血液學指標是:MCV<80 fL,MCH<27 pg,Hb A2<3.5％；β-地貧進行分子篩查的血液學指標是:①MCV<80 fL,MCH<27 pg和Hb A2>3.5％；②表現(xiàn)出Hb E電泳帶；③Hb F>5.0％。δ-地貧進行

4、分子篩查的血液學指標是:①Hb A2<2.0％；②2.0％　　 3.分子分析:用酚/氯仿方法提取基因組DNA。采用Gap-PCR技術(shù)、反向點雜交(RDB)技術(shù)檢測常見α-地貧缺失突變和點突變；采用反向點雜交(RDB)技術(shù)檢測常見β-地貧點突變；用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)檢測δ-地貧

5、突變。采用多重連接酶探針擴增反應(MLPA)技術(shù)或DNA測序技術(shù)檢測少見及未知的α-和β-珠蛋白基因缺失突變或點突變。所有β-地貧陽性的樣本均檢測了α-地貧常見點突變和缺失突變。所有δ-地貧陽性的樣本均檢測了α-地貧常見點突變和缺失突變及β-地貧常見點突變。異常血紅蛋白帶的所有樣品,均按照條帶的位置,分別進行了α-、β-和δ-和珠蛋白基因鏈的基因測序分析。采用Real-time PCR技術(shù)對新發(fā)現(xiàn)的α2珠蛋白基因突變進行功能分析。采用基

6、于PCR的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)對δ-地貧新突變進行β-珠蛋白基因簇單倍型分析。
　　 4.統(tǒng)計學分析:當前人口和預計將來重型和中間型地貧出生人口的統(tǒng)計源數(shù)據(jù)來自于“廣西壯族自治區(qū)計劃生育人口通報”。使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0,采用Pearsonx2檢驗的方法比較不同民族和不同地區(qū)之間的地貧基因攜帶率,采用x2分割法將不同民族與地區(qū)間地貧攜帶率進行多重比較。采用兩獨立樣本t檢驗方法比較新突變基因和正?；?qū)Ζ?珠

7、蛋白基因mRNA水平的影響。用Hardy-berg平衡公式,計算不同地貧等位基因頻率和雜合子頻率,判斷該調(diào)查群體是否處于Hardy-berg平衡。
　　 結(jié)果
　　 血紅蛋白病的人群發(fā)病率
　　 本研究總結(jié)并分析了1016個α-地貧等位基因和372個β-地貧等位基因的分子特點和及在不同民族和地區(qū)中的分布規(guī)律。在α-和β-地貧基因中,6個最常見的α-地貧突變和8個最常見的β-地貧突變分別占α和β珠蛋白肽鏈突變的98

8、.9％和98.1％。漢族、壯族及瑤族的α-地貧和β-地貧的突變攜帶率分別為:15.71％(528/3361)和6.43％(261/3361)、20.12％(336/1670)和7.01％(117/1670)、20.84％(129/619)和5.17％(32/619),統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)α-地貧在漢族和壯族之間、漢族和瑤族之間的攜帶率存在顯著性差異(P<0.0001),而在壯族和瑤族之間沒有顯著性差異(P>0.05)。β-地貧攜帶率在三個民族

9、之間的沒有顯著性差異。同時,我們分析了α-和β-地貧的發(fā)病率在廣西6個地區(qū)的分布特點。結(jié)果顯示,僅百色和賀州兩地區(qū)的α-地貧突變攜帶率比其它4個地區(qū)的α-地貧突變攜帶率要高(P<0.05),α-地貧突變攜帶率在其它地區(qū)及β-地貧突變攜帶率在各地區(qū)之間均沒有顯著件差異(P>0.05)。因在本研究中,只發(fā)現(xiàn)了9例δ-地貧,我們沒有在不同民族和地區(qū)之間進行比較分析。根據(jù)檢測的結(jié)果,我們認為δ-130(A→G)和-77(T→C)在廣西地區(qū)應該較

10、為多見。
　　 6種新突變和2種少見突變
　　 本次研究我們發(fā)現(xiàn)了1種發(fā)生在α2-珠蛋白基因和5種發(fā)生在δ珠蛋白基因的新突變。檢測到的α2-珠蛋白基因新突變?yōu)镃D13(GCC→TCC),(HBA2:c.40G→T,Genbank ID.GU145033),共2例。我們采集其中一個家系,通過反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR技術(shù)分析突變對α-珠蛋白基因mRNA水平的影響。采用內(nèi)參和靶基因的雙標準曲線相對定量的方法,內(nèi)參采用β-珠蛋白基因

11、。突變組α-珠蛋白mRNA相對含量為0.229±0.103(n=5),正常對照組α-珠蛋白mRNA相對含量為0.162±0.229(n=5)。應用兩獨立樣本的t檢驗方法進行統(tǒng)計學分析表明,新突變不影響α-珠蛋白基因mRNA水平,因此,該突變應該屬于靜止型突變或不引起地貧表型的異常血紅蛋白突變。
　　 Hb Westmead的血液學特征
　　 本研究中我們共檢測到89例(1.55％)Hb WS突變,其攜帶率儀次于-SEA、

12、-α3.7和-α4.2,為最常見α-地貧非缺失型突變。89例Hb WS突變樣本中,11例(12.36％)合并β-地貧突變,5例合并α-地貧突變。為進一步探討Hb WS的特征,我們對本研究中的76例Hb WS突變雜合子及62例來自于臨床實驗室的攜帶有Hb WS突變的樣本依據(jù)α-基因型的不同進行分組,然后比較各組之間的血液學參數(shù)。比較的結(jié)果顯示,大部分血液學參數(shù)在各組之間均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。當Hb WS合并-SEA(-SEA

13、/αWSα)時,Hb WS可使地貧的表型加重,表現(xiàn)為Hb H病的特征。且對女性的影響似乎比對男性的影響更明顯。
　　 討論
　　 本研究調(diào)查了廣西地區(qū)血紅蛋白病的分子流行病學特征。結(jié)果顯示,血紅蛋白病在該地區(qū)的人群攜帶率高達24.51％,尤其是α-地貧的人群攜帶率達17.55％。從而首次明確了廣西地區(qū)α-地貧的攜帶率在中國南方是最高的,我們還首次報道了中國廣西地區(qū)δ-地貧的攜帶率(1.36％)。本研究闡述了廣西普通人群中

14、的Hb H病及中間型地貧的攜帶率和基因型。此外,我們通過對5789例樣品全部進行分子篩查的方法,首次準確報道了三種常見的靜止型α-地貧突變(-α3.7,-α4.2和αWSα)在廣西地區(qū)的流行情況。與以往所進行的研究通?；诓∪硕?本研究通過血液學表型和基因型分析相結(jié)合的方式,首次確定了普通人群中血紅蛋白病的攜帶率。將我們的研究結(jié)果與已有的結(jié)果相比,α-和β-地貧均呈現(xiàn)出較高的攜帶率。我們認為這一現(xiàn)象的因為主要是因為本研究采取了先進技術(shù)

15、,以及明確了靜止型α-地貧的攜帶率。
　　 本研究分析了血紅蛋白病在廣西地區(qū)三個主要的民族(漢、壯和瑤)之間的分布特點。除了α-地貧在漢族與壯族,漢族與瑤族之間的差異有統(tǒng)計學意義之外,α-地貧在壯族和瑤族及β-地貧在三個民族中的分布無顯著差別。我們認為,這一結(jié)果應該可以進一步證明中國人群可能起源于同一個種族,壯族及瑤族與漢族之間α-地貧突變攜帶率的差異可能是遺傳漂變和居住地相對隔離及特殊風俗如近親通婚等因為所致。同時,通過分析血

16、紅蛋白病在廣西不同地區(qū)的分布情況,我們可以看出α-、β-地貧的分布和攜帶率與G6PD缺乏癥相一致,從而進一步證明α-、β-珠蛋白基因突變與G6PD基因突變可能同時有對抗瘧疾的作用。
　　 本研究的結(jié)果顯示,血紅蛋白病特別是α-和β-地貧在廣西地區(qū)已成為很嚴重的公共衛(wèi)生問題。我們的調(diào)查結(jié)果對于地貧的人群預防有以下指導意義:(1)僅α-和β-地貧在廣西地區(qū)均有一個比較窄的突變譜,6種常見的α-地貧突變和8種常見的β-地貧突變分別約占

17、α-和β-地貧的99％和98％。我們可以據(jù)此設(shè)計經(jīng)濟有效的分子檢測方法。(2)α-復合β-地貧在廣西地區(qū)的攜帶率高達1.36％。因此遺傳咨詢時,如果夫妻中一方有α-地貧或β-地貧時,另一方都應檢測α-地貧突變。(3)除了Hb CS,Hb QS,Hb WS、Hb E等能導致地中海貧血的異常血紅蛋白,其余的異常血紅蛋白以及δ-地貧在廣西地區(qū)的發(fā)生率比較低。δ-地貧在廣西人群中的攜帶率為0.16％,遠低于意大利(2.5％)與塞浦路斯(1.47

18、％)人群的攜帶率。因此我們認為,δ-合并β-地貧所致的誤診現(xiàn)象在廣西地區(qū)應該也比較少。在鑒別到的9種異常血紅蛋白類型中,僅Hb Q-Thailand表現(xiàn)出輕度的地中海貧血表型。進行遺傳咨詢時,應予注意。(4)Hb H病和中間型地貧的預防在產(chǎn)前診斷中非常重要。兩種常見的基因型應引起高度注意,一是-SEA/合并Hb WS突變(-SEA/αWSα)所致的Hb H?。欢怯搔?地貧雜合子合并α-珠蛋白基因三聯(lián)體所致的中間型β-地貧。這兩種基因型