人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外的分離培養(yǎng)及在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下向心肌樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的： 心肌細(xì)胞丟失、瘢痕形成及心室重構(gòu)是造成心臟功能惡化的主要因素，也是最終導(dǎo)致慢性充血性心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)。細(xì)胞移植治療是治療心臟疾病的一種新策略。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)目前被認(rèn)為是細(xì)胞移植治療最理想的種子細(xì)胞。研究BMSCs體外定向分化為心肌樣細(xì)胞對(duì)細(xì)胞移植治療心臟疾病具有重要的理論和臨床意義。 本課題旨在通過血管緊張素II化學(xué)誘導(dǎo)等方法體外誘導(dǎo)BMSCs定向分化，檢測(cè)BMSCs是否可分化為心肌樣細(xì)胞，

2、觀察血管緊張素II對(duì)BMSCs生長(zhǎng)增殖的影響，對(duì)BMSCs分化的可能機(jī)制作一探討。本研究以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一、體外分離、純化、傳代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HBMMSc)。第二、血管緊張素II體外對(duì)HBMMSc向心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的研究。 方法： 1.HBMMSc的分離，培養(yǎng)和傳代及鑒定標(biāo)本來源于正常人的骨髓。采用淋巴細(xì)胞分離液行密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，再利用貼壁篩選法純化骨髓間充質(zhì)

3、干細(xì)胞后，進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的觀察、表面抗原的鑒定。 2.HBMMScs在血管緊張素II的誘導(dǎo)下向心肌細(xì)胞的培養(yǎng)分化及心肌細(xì)胞的鑒定。收集第8代hBMMSCs，分4組為實(shí)驗(yàn)組3組和空白對(duì)照組。用0.1 μ mol/L Ang II誘導(dǎo)孵育hBMMSCs 24h。通過倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞是否具備心肌樣細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及是否表達(dá)心肌特異性蛋白c

4、TnI，GATA-4，Nkx2.5。 結(jié)果： 1.hBMMScs原代培養(yǎng)接種24h貼壁完成，2-3天細(xì)胞呈梭形，第9天形成多個(gè)克隆，第14-16天細(xì)胞融合成單層，梭形突起變長(zhǎng)，排列有明顯方向性，細(xì)胞排列成漩渦狀。傳代細(xì)胞24h內(nèi)完全貼壁，伸展成梭形，開始迅速增殖，7天即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征。隨代數(shù)增加，細(xì)胞得到純化，梭形細(xì)胞達(dá)95％以上。連續(xù)傳代至P8，細(xì)胞由梭形變?yōu)槠教?、寬大，分裂相減少，細(xì)胞質(zhì)

5、疏松，可見空泡。傳至P10，部分細(xì)胞變成圓形，折光增強(qiáng)，脫壁死亡。隨著傳代次數(shù)的增加，克隆形成率逐漸下降，10代后無明顯克隆出現(xiàn)。流式細(xì)胞測(cè)定分離提純后的hBMMScs表達(dá)CD29和CD44，不表達(dá)CD34和CD45。 2.Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞第8-10d即呈棒狀，第18-21d細(xì)胞為長(zhǎng)桿狀，走向便趨一致。電泳檢測(cè)證實(shí).AngII誘導(dǎo)的細(xì)胞第2、3、4、5周已經(jīng)表達(dá)cTnI，NkKX2.5，GATA-4，并且隨時(shí)間推移，蛋白表