大鼠脊髓D-,1-和D-,2-受體陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征以及6-OHDA損傷誘導(dǎo)其反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多巴胺(dopamine，DA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，因此成為近五十年研究的焦點(diǎn)之一。已有研究表明，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要遞質(zhì)的DA密切牽涉到正常軀體的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶和內(nèi)臟活動(dòng)等調(diào)節(jié)機(jī)能，以及帕金森病、亨廷頓病、藥物成癮、精神分裂癥等病理過(guò)程。
　　 DA的神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)通過(guò)其受體的作用而實(shí)現(xiàn)。研究證實(shí)DA受體可分為D1-D5，其中D1和D5在分子結(jié)構(gòu)和機(jī)能上較為接近，因此歸為D1受體，而D2-

2、D4通稱(chēng)為D2受體。以往的研究證實(shí)在哺乳動(dòng)物位于中腦黑質(zhì)的DA神經(jīng)元主要投射到紋狀體，所釋放的DA通過(guò)D1和D2受體調(diào)節(jié)紋狀體神經(jīng)元的活動(dòng)。DA及其受體與脊髓之間的聯(lián)系一直是神經(jīng)科學(xué)者欲證實(shí)的問(wèn)題之一，雖然已有眾多作者借助組化、免疫組化、原位雜交、放射自顯影以及電鏡等技術(shù)方法對(duì)其進(jìn)行了觀察，但對(duì)這些受體陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)學(xué)方面的認(rèn)識(shí)目前還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。為此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)借助免疫組織化學(xué)單標(biāo)記和熒光免疫組化雙標(biāo)記以及免疫印跡技術(shù)方法對(duì)正常大鼠脊髓不

3、同部位和區(qū)域的DA受體陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行了系列觀察：包括D1、D2兩種受體陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、大小、突起數(shù)量和長(zhǎng)度，以及比較脊髓不同部位和區(qū)域的陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征。同時(shí)，本研究也設(shè)計(jì)借助6-羥基多巴(6-hydroxy-dopamine，6-OHDA)損毀實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型，從形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)脊髓不同部位和區(qū)域的D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量和分布形式的變化，以及D1、D2抗原表達(dá)的變化，為深入探討和徹底證實(shí)DA及其受體陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)特征

4、、生理機(jī)能和在脊髓損傷病理機(jī)制中的作用提供形態(tài)學(xué)資料。
　　 方法：
　　 1.免疫組織化學(xué)方法通過(guò)免疫組化方法觀察正常SD大鼠不同部位不同區(qū)域脊髓灰質(zhì)D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量和分布特征，以及黑質(zhì)-紋狀體去DA能神經(jīng)支配后脊髓灰質(zhì)D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的變化。運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)探察D1與CHAT抗原兩者相互共存的情況。
　　 2.Western-blot(免疫印跡)方法應(yīng)用Western-blo

5、t觀察證實(shí)正常脊髓灰質(zhì)不同部位和不同區(qū)域D1、D2蛋白表達(dá)量的差異以及損傷誘導(dǎo)其變化的規(guī)律。3.動(dòng)物模型的構(gòu)建和評(píng)價(jià)借助大鼠腦定位儀，在SNc與MFB分別注射3μl6-OHDA(濃度為3μg/μl)制作損傷模型。模型動(dòng)物的檢測(cè)和評(píng)價(jià)包括：①行為學(xué)(握力測(cè)試，APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn))測(cè)試。②組織病理學(xué)染色(黑質(zhì)區(qū)域的HE和Nissel組化染色，黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域的TH免疫組化染色)。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠脊髓DA受體陽(yáng)性

6、神經(jīng)元形態(tài)及其分布特征1.1脊髓灰質(zhì)D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元各自的形態(tài)特征和分布規(guī)律本實(shí)驗(yàn)對(duì)正常SD大鼠脊髓DA受體陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行免疫組化特異性標(biāo)記，光鏡觀察顯示：D1受體陽(yáng)性細(xì)胞形狀為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞中央淡染，光鏡高倍鏡下陽(yáng)性產(chǎn)物為顆粒狀定位于細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)?？梢?jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)元具有少量突起，分支較少，形態(tài)學(xué)顯示具備樹(shù)突的特征。D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布脊髓灰質(zhì)前角，中間帶和后角少見(jiàn)D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元。陽(yáng)性神經(jīng)元在頸、胸、腰骶脊髓三個(gè)不同

7、部位的分布密度沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)性。
　　 D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元胞體也呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形，陽(yáng)性神經(jīng)元中間淡染，陽(yáng)性產(chǎn)物為顆粒狀定位于細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)。光鏡觀察顯示陽(yáng)性神經(jīng)元大小不一，而且在脊髓前角明顯可見(jiàn)大體積的神經(jīng)元成群聚集于前外側(cè)部，中等大小的位于內(nèi)側(cè)，在脊髓中間帶和后角的為中等大小和小細(xì)胞。無(wú)論陽(yáng)性神經(jīng)元胞體大小，其突起均不明顯。在脊髓三個(gè)區(qū)域和部位的分布D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元，免疫組化資料未見(jiàn)明顯差異。
　　 1.2脊髓不同區(qū)

8、域和部位D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元相互之間形態(tài)和分布的比較脊髓灰質(zhì)不同區(qū)域D1、D2陽(yáng)性神經(jīng)元比較結(jié)果顯示，在脊髓前角、中間帶和后角三個(gè)不同區(qū)域兩類(lèi)陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量明顯不同：即D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元明顯多于D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元。但是脊髓前角D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元的直徑明顯大于D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元。在頸脊髓、胸脊髓和腰骶脊髓三個(gè)部位的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量均明顯更多D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元，前角D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元平均直徑均大于D2受體陽(yáng)性神經(jīng)

9、元。
　　 2.脊髓D1和ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元相關(guān)蛋白共存關(guān)系的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在頸、胸、腰骶脊髓前角的光鏡觀察顯示，D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元形狀不規(guī)則，體積較大，明顯具有ChAT(膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶)陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征，本實(shí)驗(yàn)為此借助D1和ChAT免疫熒光雙標(biāo)記，光鏡觀察結(jié)果顯示，在頸、胸、腰骶脊髓前角的D1與ChAT之間的確存在相互共存。
　　 3.脊髓不同部位D1、D2受體蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)探測(cè)借助Western-blot方法對(duì)大鼠脊

10、髓不同區(qū)域和部位D1、D2受體蛋白表達(dá)的探測(cè)和比較結(jié)果顯示，脊髓灰質(zhì)前角D1受體蛋白的表達(dá)明顯高于后角。而在頸、胸、腰骶脊髓三個(gè)不同部位之間D1受體蛋白的表達(dá)差異不明顯。在脊髓灰質(zhì)不同區(qū)域，而D2受體蛋白在后角的表達(dá)則明顯高于前角，而且在頸、胸、腰骶脊髓三個(gè)不同部位D2受體蛋白的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：即在腰骶脊髓的表達(dá)明顯高于其它部位。脊髓三個(gè)不同部位的前角均有D1、D2受體蛋白的表達(dá)，但其表達(dá)增加量不同，比較結(jié)果顯示D2受體蛋白的表達(dá)增

11、加量明顯高于D1。
　　 4.6-OHDA損傷誘導(dǎo)大鼠行為學(xué)和組織病理學(xué)變化的實(shí)驗(yàn)觀察4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)檢測(cè)借助握力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型動(dòng)物的肌張力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)機(jī)能。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)后與手術(shù)前相比懸掛時(shí)間明顯延長(zhǎng)。腹腔注射阿樸嗎啡實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘T導(dǎo)出動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
　　 4.26-OHDA誘導(dǎo)黑質(zhì)、紋狀體、脊髓的組織病理學(xué)變化的形態(tài)學(xué)證實(shí)1)組織病理學(xué)檢查：HE染色顯示，模型動(dòng)物損傷組黑質(zhì)致密部較對(duì)照組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，并

12、伴隨炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。Nissel組化染色顯示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黑質(zhì)神經(jīng)元明顯減少，同時(shí)可見(jiàn)神經(jīng)元內(nèi)尼氏體出現(xiàn)消溶和分解等病理變化。
　　 2)免疫組織化學(xué)探察：
　　 ①光鏡觀察顯示作為DA標(biāo)記物的TH陽(yáng)性神經(jīng)元在模型動(dòng)物的中腦黑質(zhì)損傷組其數(shù)量顯著減少，僅有少數(shù)神經(jīng)元幸存，而且突起明顯變短和減少。紋狀體內(nèi)多巴胺能纖維主要來(lái)自于中腦SNc的投射，因此損傷導(dǎo)致紋狀體TH陽(yáng)性纖維也明顯減少。脊髓灰質(zhì)不同區(qū)域的TH陽(yáng)性纖

13、維也顯著的減少，但脊髓不同部位TH陽(yáng)性纖維的減少量差異不明顯。
　　 ②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷組脊髓灰質(zhì)D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的變化。相比于對(duì)照組，損傷組脊髓灰質(zhì)前角D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，而且在頸、胸、腰骶脊髓三個(gè)不同部位的分布密度均增加，尤其以腰骶脊髓增加的量最明顯。與對(duì)照組相比，脊髓灰質(zhì)不同區(qū)域損傷組D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，三個(gè)不同部位的分布密度也明顯增加，以腰骶脊髓增加的量更顯著。損傷后兩類(lèi)陽(yáng)性神

14、經(jīng)元計(jì)數(shù)比較，脊髓不同部位不同區(qū)域D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的增加量均更加明顯。
　　 5.6-OHDA損傷誘導(dǎo)脊髓不同部位D1、D2受體蛋白表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)探測(cè)相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的頸、胸、腰骶脊髓灰質(zhì)三個(gè)不同部位D1受體蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其以腰骶脊髓增加的量明顯。同樣，損傷組D2受體蛋白的表達(dá)在頸、胸、腰骶脊髓三個(gè)不同部位均較對(duì)照組高，而且以腰骶脊髓的增加最顯著。6-OHDA損傷誘導(dǎo)脊髓三個(gè)不同部位的D1和D2受體蛋白表達(dá)的比較結(jié)果

15、顯示，D2受體蛋白的表達(dá)明顯高于D1受體蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 1.D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元主要存在于脊髓灰質(zhì)前角，它們?cè)诩顾枞齻€(gè)部位的分布沒(méi)有明顯差異。在脊髓灰質(zhì)前角，D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元與ChAT相互之間存在共存，提示D1受體陽(yáng)性神經(jīng)元可能牽涉到脊髓前角運(yùn)動(dòng)機(jī)能的調(diào)節(jié)。D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元呈現(xiàn)明顯的大、中、小三種類(lèi)型，而且分別具有特定區(qū)域性分布，在脊髓灰質(zhì)前角、中間帶和后角不同區(qū)域D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的廣泛分布和大量聚集，可

16、能提示該類(lèi)神經(jīng)元與脊髓感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、內(nèi)臟活動(dòng)的調(diào)控有關(guān)。
　　 2.D1受體蛋白在頸、胸、腰骶脊髓前角區(qū)域特征的高表達(dá)，提示該受體蛋白可能牽涉到脊髓的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)能。而D2受體蛋白在脊髓灰質(zhì)前角和后角的高表達(dá)以及在腰骶脊髓特征性的高表達(dá)，提示其對(duì)脊髓不同機(jī)能活動(dòng)具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。脊髓不同區(qū)域和部位D2受體蛋白的優(yōu)勢(shì)性表達(dá)和陽(yáng)性神經(jīng)元的廣泛分布，表明其對(duì)脊髓功能的調(diào)節(jié)作用比D1更為重要。
　　 3.6-OHDA損傷誘導(dǎo)黑質(zhì)-

17、紋狀體去DA能神經(jīng)支配，導(dǎo)致模型動(dòng)物肌張力增加，黑質(zhì)、紋狀體和脊髓灰質(zhì)多巴胺神經(jīng)元和突起減少，結(jié)果證實(shí)6-OHDA特異性毒性作用、損傷模型的制作成功、黑質(zhì)-脊髓DA神經(jīng)通路的存在。黑質(zhì)-紋狀體去DA能神經(jīng)支配誘導(dǎo)脊髓灰質(zhì)D1、D2受體陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量增加以及D1、D2受體蛋白的高表達(dá)，結(jié)果一方面提示黑質(zhì)-脊髓DA神經(jīng)通路對(duì)脊髓灰質(zhì)特種類(lèi)型神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用，另一方面表明DA受體蛋白和陽(yáng)性神經(jīng)元對(duì)黑質(zhì)-脊髓DA通路去神經(jīng)支配的突觸后反應(yīng)的敏