胰島對(duì)胰腺干細(xì)胞促成熟作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　 1.以成年大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采取自膽總管逆行灌注膠原酶-V消化胰腺并用Ficoll進(jìn)行梯度離心的方法獲取純化的胰島，檢測(cè)胰島的產(chǎn)量、純度、存活率及生物學(xué)活性，以確定胰島分離及純化方法是否適宜可靠。2.以胎鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，獲取其胰芽并通過(guò)膠原酶消化法取得原代細(xì)胞并進(jìn)行純化后培養(yǎng)，檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，確定胰腺干細(xì)胞的性質(zhì)及分離和培養(yǎng)方法是否可靠。3.在胰腺干細(xì)胞傳統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)加入胰島進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察誘導(dǎo)分化效果

2、并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，探討其機(jī)制?？傊?，通過(guò)以上研究，為胰腺干細(xì)胞移植治療糖尿病應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)支持和理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 第一部分：胰島的分離與純化。以成年Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采取膽總管內(nèi)逆行灌注膠原酶-V的方法消化胰腺，并將獲得的胰島懸液使用Ficoll溶液梯度離心進(jìn)行純化。而后檢測(cè)所得胰島的產(chǎn)量、純度、存活率及培養(yǎng)液中基礎(chǔ)胰島素水平，并進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)，計(jì)算胰島刺激指數(shù)。以判斷胰島分離提純方法是

3、否可靠。
　　 第二部分：胰腺干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。以胎鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，取得其胰芽后以膠原酶消化法獲得原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并采用差速貼壁的方法進(jìn)行純化，取傳代后細(xì)胞行細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)、巢蛋白(Nestin)、胰高血糖素(Glucogon)和胰島素(Insulin)等指標(biāo)的免疫組織化學(xué)及RT-PCR檢測(cè)。以證實(shí)所得細(xì)胞的干細(xì)胞性質(zhì)，并確定干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的可行性與可靠性。
　　 第三部分：胰腺干細(xì)胞的誘導(dǎo)分

4、化。選取在第二部分中經(jīng)檢測(cè)證實(shí)的胰腺干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，實(shí)驗(yàn)共分為三組：胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組（I組），干細(xì)胞，胰島混合培養(yǎng)組（II組）及胰島單獨(dú)培養(yǎng)組（III組）。各培養(yǎng)組均采用相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。共培養(yǎng)組在使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基的同時(shí)加入50個(gè)/孔的胰島（直徑>100um)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定基礎(chǔ)胰島素水平，進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)并計(jì)算胰島素刺激指數(shù)；誘導(dǎo)分化后再次檢測(cè)CK-19、Nestin、Glucogon和Insulin等指標(biāo)，觀察胰腺

5、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的成熟情況，評(píng)價(jià)混合培養(yǎng)組中胰島對(duì)于胰腺干細(xì)胞的促成熟作用，并研究其機(jī)制。
　　 以上三部分?jǐn)?shù)據(jù)以x±s表示，以SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。均數(shù)間采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)以重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：大鼠胰島的分離與純化。每只大鼠胰腺可獲得胰島細(xì)胞(345±38)個(gè)。經(jīng)梯度離心純化后獲得(254±42)個(gè)胰島細(xì)胞，平均純度為(87±

6、l3)％，平均回收率為74.3％。AO/PI染色后顯示胰島制備物存活率大于95％。所得胰島培養(yǎng)24小時(shí)后基礎(chǔ)胰島素為4.21mIU/L，胰島素刺激指數(shù)為2.31。
　　 第二部分：胰腺干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。由胎鼠胰芽消化得到原代細(xì)胞，通過(guò)差速貼壁的方法純化后，可見(jiàn)細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)良好，多邊形。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果示CK-19、Nestin和Glucogon在細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，誘導(dǎo)前細(xì)胞不表達(dá)Insu

7、lin。
　　 第三部分：胰腺干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)分化后，干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組和干細(xì)胞-胰島共培養(yǎng)組中除CK-19、Ncstin和Glucogon繼續(xù)表達(dá)外，Insulin也開(kāi)始表達(dá)。而且結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組表達(dá)CK-19及Insulin蛋白的細(xì)胞陽(yáng)性率高于干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)經(jīng)膽總管逆行灌注膠原酶-V并用Ficoll進(jìn)行梯度離心純化的方法獲取胰島的產(chǎn)率、純

8、度高，存活率滿意，生物活性良好。(2)采用膠原酶消化法消化胎鼠胰芽組織，而后由差速貼壁法進(jìn)行純化，是獲得胰腺干細(xì)胞的可靠方法。(3)自胎鼠胰芽獲得的細(xì)胞表達(dá)胰腺干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物，在蛋白質(zhì)及基因水平驗(yàn)證了其干細(xì)胞性質(zhì)。(4)傳統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)小部分胰腺干細(xì)胞分化為表達(dá)Insulin的相對(duì)成熟的B前體細(xì)胞。(5)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入胰島后，可模擬胰腺內(nèi)環(huán)境，通過(guò)多種因子作用促進(jìn)胰腺干細(xì)胞成熟。(6)相關(guān)檢測(cè)提示，共培養(yǎng)后CK-19在胰腺干細(xì)