成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥關系及中藥干預作用的實驗研究.pdf

1、一、目的：揭示成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK4、p21與實驗性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關系，并在細胞分子水平研究健骨顆粒對成骨細胞G1期調(diào)控的影響，進一步探討中醫(yī)藥有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的詳細機制。 二、方法：1、去卵巢骨質(zhì)疏松模鼠成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白的改變及健骨顆粒干預作用 (1)建立實驗動物病理模型：切除6月齡SD大鼠卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型。(2)具體分組與藥物干預：170只6月齡SD雌性大鼠，隨機

2、分成假手術組50只和手術組120只。手術組進行雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除術，假手術組除未行卵巢結(jié)扎切除外，其余步驟與手術組相同。手術組在手術后再分成模型組70只，預防組50只。預防組于術后第2天開始喂服健骨顆粒2g·kg-1·d-1，每天1次。術后13周模型組再隨機分出20只為治療組。治療組喂服健骨顆粒2g·kg-1·d-1，假手術組和模型組喂服生理鹽水2ml·d-1。健骨顆粒以生理鹽水溶解后灌服。治療組、假手術組及模型組均從術后第13周起灌服。

3、所有大鼠于術后4、8、12、18、24周分批取材，每批每組各處死10只。(3)指標檢測：應用雙能X線骨密度儀測定全身骨密度；運用放射免疫法檢測血清E2水平；運用免疫組織化學方法檢測骨組織中成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK4、p21蛋白表達。2、健骨顆粒含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白的影響 (1)建立成骨細胞體外培養(yǎng)體系：原代細胞用酶消化法從新生SD大鼠顱蓋骨獲取，經(jīng)堿性磷酸酶染色、鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色鑒定后，取第

4、三代細胞進行實驗。(2)健骨顆粒含藥血清制備：取3月齡清潔級雄性sD大鼠20只，隨機分為含藥血清組和空白血清組，每組10只，含藥血清組給予健骨顆粒2g·kg-1·d-1，空白血清組灌服生理鹽水2ml·d-1，二組均連續(xù)灌胃7天，取血制備成健骨顆粒含藥血清和生理鹽水空白血清。(3)檢測指標：MTT法檢測不同含藥血清濃度對成骨細胞增殖的影響，得出最佳含藥血清濃度；以最佳濃度的含藥血清作用于成骨細胞24h、48h和72h，以空白血清干預的細胞

5、為對照，運用流式細胞術進行細胞周期分析、檢測Cyclin D1陽性細胞百分含量，運用免疫細胞化學法檢測Cyclin D1、CDK4、p21蛋白的表達，運用RT-PCR法檢測Cyclin D1、CDK4、p21 mRNA表達。 三、結(jié)果：1、術后12周后，模型組全身BMD明顯下降(P<0.01)，且隨時間推移下降趨勢明顯，預防組、治療組BMD明顯高于同期模型組，但不及假手術組；模型組血清E2水平下降明顯(P<0.01)，預防組、治

6、療組E2水平明顯高于同期模型組，預防組高于治療組，但不及假手術組；Cyclin D1、CDK4蛋白陽性表達主要定位于骨小梁表面的成骨細胞，假手術組有Cyclin D1、CDK4蛋白陽性表達，模型組、預防組、治療組表達強于假手術組，以預防組表達最高，治療組次之；p21蛋白陽性表達部位與Cyclin D1相似，假手術組、模型組、預防組和治療組均有明顯陽性表達，假手術組表達最低，模型組的表達維持在較高水平，在各時期均明顯高于同期假手術組、預防

7、組和治療組。2、(1)MTT法檢測顯示健骨顆粒含藥血清濃度為20％時，體外培養(yǎng)成骨細胞增殖速度最快，明顯快于同濃度空白血清組(P<0.05)。(2)流式細胞術檢測細胞周期分布結(jié)果顯示，隨著干預時間延長，G0/G1期細胞分數(shù)下降，而S期、G2/M期細胞分數(shù)上升，增殖指數(shù)(PI)升高，以含藥血清組變化明顯，干預24h、48h、72h，其S期細胞分數(shù)、PI均高于空白血清組(P<0.05)；流式細胞術檢測Cyclin D1陽性細胞百分含量，含藥

8、血清組明顯高于空白血清組(P<0.01)。(3)免疫細胞化學檢測顯示，體外成骨細胞Cyclin D1、CDK4蛋白有陽性表達，表達部位主要在細胞核，隨著干預時間的延長，含藥血清組和空白血清組Cyclin D1、CDK4蛋白表達呈上升趨勢，含藥血清組明顯高于空白血清組(P<0.05或P<0.01)；在p21的表達上，二組隨時間的推移則呈下降趨勢，且含藥血清組低于空白血清組，干預48h、72h時二組比較有顯著性差異(P<0.01)。(4)R

9、T-PCR檢測結(jié)果與免疫細胞化學檢測結(jié)果基本一致，干預48h、72h，含藥血清組Cyclin D1、CDK4 mRNA表達明顯高于空白血清組(P<0.05或P<0.01)；干預24h，含藥血清組p21 mRNA表達明顯低于空白血清組(P<0.05)，干預48h、72h，二者的差距更明顯(P<0.01)。 四、結(jié)論：1.去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠發(fā)病過程中，隨著雌激素水平的下降，成骨細胞Cyclin D1、CDK4、p21蛋白出現(xiàn)明顯

10、高表達，成骨細胞增殖加快，同時，成骨細胞周期受阻滯亦增多，成骨細胞數(shù)量仍顯相對不足，骨形成低于骨吸收，最終導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。2.健骨顆粒能提高去卵巢骨質(zhì)疏松模型鼠成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK4的表達，抑制負性調(diào)節(jié)因子p21的表達，促進成骨細胞增殖，這可能是健骨顆粒防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機制之一。3 健骨顆粒能提高體外培養(yǎng)成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK4的表達，抑制負性調(diào)節(jié)因子p21的表達，加快細胞