PI3K-Akt信號(hào)途徑抑制缺血缺氧心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻?，心肌局部血流量迅速減少，發(fā)生缺血缺氧損害和心功能減退，不僅引起心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，成為燒傷早期缺血缺氧的重要啟動(dòng)因素之一。根據(jù)上述認(rèn)識(shí)，提出了燒傷后早期缺血缺氧損害的“休克心”假說(shuō)。 PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。P13K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，進(jìn)一步引起信號(hào)蛋白Akt活化。活化的Akt通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-kB、GSK-3、FKHR、D21

2、Cip1和p27Kip1等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。 P13K/Akt信號(hào)途徑在燒傷早期心肌細(xì)胞的表達(dá)、作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確。我們假設(shè)：在燒傷早期心肌細(xì)胞遭受缺血缺氧損傷的同時(shí)，P13K/Akt信號(hào)途徑即被激活，并可能通過(guò)調(diào)控鈣濃度、線粒體膜穩(wěn)定性以及凋亡基因表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用，P13K/Akt/HIF-1α則可能是這種抗凋亡作用的重要分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)這一假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證。 材料方法： 采用動(dòng)

3、物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法。 1.建立燙傷大鼠模型，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)心肌組織P13KmRNA表達(dá)變化，Westernblot檢測(cè)心肌組織P13K及磷酸化Akt蛋白表達(dá)。 2.建立體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧模型，應(yīng)用P13K/Akt通路特異性抑制劑LY294002及激動(dòng)劑IGF-1，并結(jié)合ELISA、激光共聚焦、TUNEL等方法等方法觀察缺血缺氧條件下該信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞活力、LDH酶活性、線粒體膜電位、胞內(nèi)鈣濃

4、度及凋亡率等指標(biāo)的影響，明確P13K/Akt信號(hào)途徑在缺血缺氧心肌細(xì)胞中的作用。 3.建立體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧模型，應(yīng)用RT-PCR觀察PI3K/Akt對(duì)P53、C-myc、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)基因以及HIF-1amRNA的影響，并應(yīng)用LY294002和Rapamycin，結(jié)合Westernblot探討可能存在的凋亡調(diào)控機(jī)制。 主要結(jié)果與結(jié)論： 1.嚴(yán)重?zé)齻缙诩从蠵13KmRNA及蛋白的高表達(dá)

5、，并伴有Akt磷酸化水平的顯著增加，說(shuō)明燒傷早期P13K/Akt途徑即被激活。 2.缺血缺氧條件下，心肌細(xì)胞活力持續(xù)下降，P13K/Akt抑制劑LY294002抑制P13K/Akt激活后，心肌細(xì)胞活力下降更為明顯。表明該途徑可能具有維持細(xì)胞活性，拮抗缺血缺氧損害的作用。 3.缺血缺氧刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，LDH漏出增加；LY294002抑制P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性較單純?nèi)毖踅M

6、明顯升高。表明P13K/Akt能夠維持質(zhì)膜穩(wěn)定性，防止因膜結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 4.心肌細(xì)胞在缺血缺氧刺激下，細(xì)胞凋亡量明顯增加。LY294002抑制P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細(xì)胞凋亡加??；予以IGF-1激活：P13K/Akt，缺血缺氧心肌細(xì)胞凋亡量明顯減少。說(shuō)明P13K/Akt的激活能夠拮抗缺血缺氧心肌細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞的內(nèi)源性保護(hù)反應(yīng)。 5.缺血缺氧6h后，心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度明顯升高，LY294002抑制

7、P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度升高更為顯著；予以IGF-1激活P13K/Akt，缺血缺氧心肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度較單純?nèi)毖毖踅M明顯下降。說(shuō)明PI3K/Akt的激活能夠減輕胞內(nèi)鈣超載，避免鈣超載引起的后續(xù)凋亡反應(yīng)。 6.缺血缺氧刺激6h、12h后，線粒體膜電位明顯下降，提示線粒體膜通透性增加；LY294002抑制P13K/Akt激活后，缺血缺氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降更為顯著；予以IGF-1激活P13K/Akt

8、，缺血缺氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降幅度明顯減小，表明P13K/Akt能夠維持線粒體膜穩(wěn)定性，防止因線粒體MPTP的開放而導(dǎo)致后續(xù)凋亡反應(yīng)的啟動(dòng)。 7.缺血缺氧心肌細(xì)胞P13K/Akt信號(hào)途徑的活化可以上調(diào)HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)P13K/Akt及mTOR蛋白磷酸化均可以在蛋白水平上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，以發(fā)揮HIF-1α的抗凋亡作用，拮抗心肌細(xì)胞的缺血缺氧損害。 8.缺血缺氧條件下，心肌細(xì)胞PI3K/Akt的活