丹參、赤芍活血化瘀有效部位配伍抗肝纖維化作用的研究.pdf

1、本研究運(yùn)用現(xiàn)代方法分別提取分離與鑒定，丹參與赤芍抗肝纖維化有效部位，通過(guò)肝纖維化大鼠模型，優(yōu)選丹參赤芍提取物的最佳配比。觀察了該配比制劑對(duì)肝纖維化大鼠的治療作用。在此基礎(chǔ)上，從細(xì)胞、分子水平研究了其抗肝纖維化有效部位混合物最佳配比對(duì)肝纖維化治療作用的機(jī)制。本研究共分為六部分： 1、丹參、赤芍抗肝纖維化有效部位提取、分離、質(zhì)量控制及結(jié)構(gòu)鑒定研究。 (1)赤芍抗肝纖維化有效部位提取工藝研究。根據(jù)芍藥苷和沒(méi)食子酸的性質(zhì)，選擇乙

2、醇為提取溶劑，運(yùn)用正交的方法對(duì)提取赤芍芍藥苷和沒(méi)食子酸的提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶媒的用量以及醇濃度進(jìn)行考察，優(yōu)選合理提取工藝。醇提浸膏用水稀釋后明膠除去鞣質(zhì)，再用大孔樹脂分離的方法，提取赤芍芍藥苷和沒(méi)食子酸，其得率為3％。結(jié)果表明，該提取工藝簡(jiǎn)便穩(wěn)定，適合工業(yè)生產(chǎn)。 (2)丹參抗肝纖維化有效部位提取工藝研究。根據(jù)丹參中丹參總酚酸的性質(zhì)，選擇水為提取溶劑，運(yùn)用正交的方法對(duì)提取丹參總酚酸的提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶媒的用量三個(gè)因素進(jìn)行了考

3、察，優(yōu)選提取工藝。遠(yuǎn)用明膠乙醇沉淀提取液中鞣質(zhì)和其他大分子物質(zhì)，在調(diào)節(jié)適合pH基礎(chǔ)上，運(yùn)用乙酸乙酯萃取丹參總酚酸有效部位，其得率大于2％。結(jié)果表明，該提取工藝簡(jiǎn)便穩(wěn)定，適合工業(yè)生產(chǎn)。 (3)丹參與赤芍抗肝纖維化有效部位及藥材的含量測(cè)定。丹參抗肝纖維化有效部位為丹參總酚酸，選用該部位中有效成分丹參素、原兒茶酸為對(duì)照品，分別用HPLC法和比色法對(duì)提取物以及藥材進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果HPLC法測(cè)定得河南洛陽(yáng)產(chǎn)丹參藥材丹參素含量最高，為0.

4、477％，上述工藝提取的丹參抗肝纖維化有效部位其丹參素的含量大于10％。藥材的平均回收率為98.75％，RSD為0.31％。提取物的回收率為99.81％，RSD為0.47％。比色法測(cè)得提取物中總酚酸含量大于80％，回收率為99.77％，RSD為0.31％，且對(duì)目關(guān)比色條件進(jìn)行了優(yōu)選。赤芍的抗肝纖維化有效部位為芍藥苷和沒(méi)食子酸類，選用該部位中的有效成分芍藥苷和沒(méi)食子酸為對(duì)照品，分別用HPLC法和比色法對(duì)赤芍總苷提取物以及藥材中芍藥苷的含量

5、和總苷中酚酸的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)相關(guān)影響條件進(jìn)行考察。結(jié)果HPLC法測(cè)定內(nèi)蒙赤峰產(chǎn)赤芍芍藥苷含量最高，為4.54％，其回收率為98.63％，RSD為0.48％。赤芍總苷提取物中芍藥苷含量大于50％，其回收率為97.73％，RSD為1.07％。比色法測(cè)得提取物中總苷中酚酸的含量大于8％，回收率為98.49％，RSD為1.46％。結(jié)果表明，該法測(cè)定赤芍、丹參及其提取物，其結(jié)果穩(wěn)定可靠。 (4)有效部位化學(xué)成分分離與鑒定。赤芍總苷提取

6、物，反復(fù)進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿，氯仿：甲醇梯度洗脫，制備薄層純化，分得6個(gè)化合物分別為：苯甲酸(Ⅰ)、沒(méi)食子酸(Ⅱ)、沒(méi)食子酸乙酯(Ⅲ)、芍藥苷(Ⅳ)、氧芍藥苷(Ⅴ)、苯甲酰芍藥苷(Ⅵ)。其中化合物Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、為首次從該植物中獲得。丹參總酚酸提取物拌硅膠后，分別用乙酸乙酯、丙酮和甲醇回流提取得乙酸乙酯、丙酮和甲醇三個(gè)部位，乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠反復(fù)柱層析得五個(gè)化合物，經(jīng)物理常數(shù)測(cè)定、波譜分析等鑒定為，4、5、4’、5’-四羥基1、2雙苯醚[Ⅰ

7、]，原二茶醛[Ⅱ]，原二茶酸[Ⅲ]，異阿魏酸[Ⅳ]，咖啡酸[Ⅴ]。丙酮部位經(jīng)硅膠柱和ODS柱層析得二個(gè)化合物，經(jīng)物理常數(shù)測(cè)定、波譜分析和已知品對(duì)照分析等鑒定為，丹參甲素[Ⅵ]，丹酚酸D[Ⅶ]，其中化合物Ⅰ為首次從丹參中分得，且為新的化合物。 2、赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位及其不同配比對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化作用的比較研究。取SD大鼠110只，隨機(jī)分為11組，皮下注射CCl4，6周后，給藥組分別給予丹參總酚酸提取物、赤芍總苷提取物，

8、以及其二者提取物不同配比混合物。給藥50天后，各給藥組血清ALT、AST、HA、LN以及肝組織羥脯氨酸的含量與模型組相比均有不同程度降低，TP和ALB也有不同程度升高，丹參、赤芍有效部位混合物作用增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)。研究結(jié)果表明，丹參、赤芍抗肝纖維化有效部位及其不同比例混合物有一定抗肝纖維化作用，混合使用優(yōu)于單個(gè)有效部位，丹參總酚酸/赤芍總苷提取物(7：3)作用最強(qiáng)，提示混合最佳配比為丹參總酚酸/赤芍總苷提

9、取物(7：3)。 3、赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)CCL4致大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用的研究。取SD大鼠70只，隨機(jī)分為7組，皮下注射CCl4，6周后，給藥組分別給予丹參總酚酸提取物和赤芍總苷提取物最佳配比混合物(丹參：赤芍7：3)。給藥50天后，除低劑量組外各給藥組血清TP、ALB、ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C及肝組織羥脯氨酸等均有程度不同的改善，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01及P＜0.001

10、)。病理組織學(xué)觀測(cè)結(jié)果顯示，赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位各劑量組與模型組比較均有顯著差異(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)提示赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)CCl4所致實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化具有良好的治療作用。 4、赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)BSA致大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用的研究。取SD大鼠，94只，每組14只(正常組10只)，隨機(jī)分為7組，皮下多點(diǎn)注射牛血清白蛋白(BSA)，免疫動(dòng)物。建模后，給藥組分別給予丹參總酚酸提取物和赤芍總苷提取物

11、最佳配比混合物(丹參：赤芍7：3)。給藥55天后，除血清TP、ALB有所生高外各給藥組血清ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C及肝組織羥脯氨酸等均有程度不同的改善，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01及P＜0.001)。病理組織學(xué)觀測(cè)結(jié)果顯示，赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位各劑量組與模型組比較均有顯著差異(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)提示赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)BSA所致實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化具有良好的治療作用。

12、 5、赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷作用的研究。取昆明小鼠，70只，隨機(jī)分為7組，連續(xù)灌胃給予丹參總酚酸提取物和赤芍總苷提取物最佳配比混合物(丹參：赤芍7：3)，七天后，末次給藥后50分鐘時(shí)開始皮下注射CCl4造模。造模次日給藥各組血清ALT和AST與模型組比較除小劑量組外均有顯著性降低(P＜0.05)，病理組織學(xué)觀測(cè)結(jié)果顯示，赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位組肝壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，以中高劑量組效果最為顯著(P＜0.

13、05)。說(shuō)明赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)四氯化碳所致小鼠肝損傷有良好的保護(hù)作用，且具有量效關(guān)系。 6、赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)大鼠肝臟星狀細(xì)胞凋亡作用的研究。通過(guò)赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位對(duì)體外培養(yǎng)的肝臟星狀細(xì)胞的作用，采用AnneinⅤPl細(xì)胞染色和雙激光管的流式細(xì)胞儀(FACS)，分析赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位提取物不同作用時(shí)間和濃度對(duì)體外培養(yǎng)的肝臟星狀細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，赤芍、丹參抗肝纖維化有效部位最佳配