P物質(zhì)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中的作用.pdf

1、骨質(zhì)疏松以骨量減少、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，進而導(dǎo)致骨強度降低、脆性增加，由此引發(fā)疼痛、骨折等一系列臨床癥狀和體征，對老年人群造成軀體、生理和社會適應(yīng)三重危害，給家庭和社會造成極大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制十分復(fù)雜。大量臨床和基礎(chǔ)研究證實瘦素-下丘腦-交感神經(jīng)系統(tǒng)參與骨代謝調(diào)控，但是感覺神經(jīng)對骨代謝的作用尚不完全確定。P物質(zhì)陽性感覺神經(jīng)末梢廣泛分布于骨骼。實驗研究已經(jīng)證實P物質(zhì)既能促進成骨細(xì)胞功能，亦能增強破骨細(xì)胞活性，體內(nèi)實驗也表明

2、P物質(zhì)在骨質(zhì)疏松調(diào)控中起到重要作用。但是P物質(zhì)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)系尚無報道。本課題的研究有助于進一步揭示P物質(zhì)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中的作用，為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的防治開辟新思路和新途徑。
　　第一部分阻斷P物質(zhì)信號對卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松性疼痛的影響
　　背景:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性疼痛與雌激素缺乏自身相關(guān)，也與骨轉(zhuǎn)換加快相關(guān)。雌激素缺乏導(dǎo)致脊髓背根神經(jīng)節(jié)P物質(zhì)表達增高，可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制之一。理論上，阻斷P物質(zhì)能夠

3、緩解雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松性疼痛，但緩解疼痛的效應(yīng)是否與降低骨轉(zhuǎn)換、提高松質(zhì)骨骨量相關(guān)尚不明確。如果阻斷P物質(zhì)信號緩解骨質(zhì)疏松性疼痛的效應(yīng)伴隨骨量的改善，這一機制可能作為未來藥物開發(fā)的靶點。
　　目的:本研究的目的是觀察阻斷P物質(zhì)信號對去卵巢誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松性疼痛的影響。并通過對骨微細(xì)機構(gòu)和骨生物力學(xué)等指標(biāo)的檢測，分析這種阻斷P物質(zhì)信號的緩解疼痛效應(yīng)是否與提高骨量和骨生物力學(xué)特性相關(guān)。
　　材料與方法:36只8周齡C57

4、BL/6J小鼠，預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機分為3組:假手術(shù)(SHAM)，卵巢切除組(OVX)和卵巢切除組接受L-703606腹腔注射組(OVX+L)，每組各12只;每組進一步分為單次腹腔注射組和連續(xù)2周腹腔注射組，各6只。OVX組動物在氯氨酮腹腔注射麻醉后行雙側(cè)卵巢切除;SHAM組行僅顯露卵巢。術(shù)后3周，SHAM組和OVX組小鼠接受溶媒β環(huán)糊精腹腔注射，OVX+L組小鼠接受NK1受體阻斷劑L-703606腹腔注射。接受單次腹腔注射干預(yù)的小鼠，在

5、干預(yù)后1/2、1、2、3、5小時行von-Frey觸痛覺測試、熱板實驗和光照甩尾實驗;接受連續(xù)2周腹腔注射干預(yù)的小鼠在第1和7天干預(yù)后24小時，以及末次干預(yù)后24和48小時行痛覺行為學(xué)測試。所有小鼠均行血清P物質(zhì)EIA檢測、背根神經(jīng)節(jié)P物質(zhì)免疫組化、脊髓P物質(zhì)EIA檢測、脊髓NK1受體western-blot以及脊髓TAC1（編碼P物質(zhì)的基因）和TACR1（編碼NK1受體的基因）mRNA實時定量PCR(real-timepolymera

6、sechainreaction，real-timePCR)檢測。接受2周干預(yù)的小鼠，腰3椎體和脛骨行生物力學(xué)測試，脛骨行micro-CT測試。
　　結(jié)果:無論接受單次腹腔注射L-703606，還是連續(xù)2周腹腔注射L-703606均能明顯延長卵巢切除小鼠痛閾。接受單次注射腹腔干預(yù)的小鼠，抗傷害刺激效應(yīng)在注射1/2小時開始出現(xiàn)，2小時達高峰，此后逐漸跌落，至干預(yù)5小時后幾乎消失。而連續(xù)兩周干預(yù)的小鼠在第1次腹腔注射后的24小時，痛閾無

7、明顯變化;在第7次和第14次腹腔注射后24小時，痛閾均明顯延長，有時間效應(yīng);且緩解傷害性刺激效應(yīng)延長至末次腹腔注射后48小時。OVX小鼠背根神經(jīng)節(jié)免疫組化結(jié)果表明P物質(zhì)陽性中小神經(jīng)元表達較SHAM組明顯增多，脊髓TAC1mRNA表達上調(diào);伴隨脊髓NK1受體蛋白及基因水平表達上調(diào);但各組間血清P物質(zhì)水平無明顯變化。單次腹腔注射L-703606后，可見背根神經(jīng)節(jié)和脊髓P物質(zhì)和NK1受體表達下調(diào)趨勢，連續(xù)兩周腹腔注射L-703606后，P物質(zhì)

8、和NK1受體表達下調(diào)趨勢更加明顯。但是，連續(xù)兩周腹腔注射L-703606干預(yù)，不能逆轉(zhuǎn)OVX導(dǎo)致的脛骨松質(zhì)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，以及脛骨和腰3椎體生物力學(xué)特性。
　　結(jié)論:卵巢切除誘導(dǎo)脊髓和背根神經(jīng)節(jié)P物質(zhì)和NK1受體表達上調(diào)可能是雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松性疼痛的主要病理機制。阻斷P物質(zhì)信號能夠有效緩解雌激素缺乏誘導(dǎo)的痛覺過敏，但不能同時改善骨量和生物力學(xué)特性。NK1受體阻斷劑可能不適合作為骨質(zhì)疏松性疼痛治療藥物的研發(fā)靶點。
　　

9、第二部分P物質(zhì)及其受體在卵巢切除后骨質(zhì)疏松小鼠松質(zhì)骨中表達變化
　　背景:P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維分布于骨骼，且NK1受體在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均有表達。文獻報道中，低鎂飲食和脊髓損傷誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松動物模型，松質(zhì)骨P物質(zhì)表達升高。但坐骨神經(jīng)切斷誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型，P物質(zhì)表達降低。卵巢切除小鼠脛骨骨骺和干骺端感覺神經(jīng)分布減少，提示P物質(zhì)表達相應(yīng)減少。但目前尚無相關(guān)報道證實這一假設(shè)。
　　目的:本研究的目的是觀察P物質(zhì)及其受體(NK

10、1受體)在去卵巢誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松性模型松質(zhì)骨中的表達變化。
　　材料與方法:48只8周齡C57BL/6J小鼠，根據(jù)干預(yù)時間和措施，隨機分為SHAM組、OVX組以及OVX+E2組（卵巢切除后立即給予雌激素替代治療），每組16只。每組實驗動物分別于干預(yù)后第3周和第6周處死一半動物。采用兩步醋酸法提取干骺端蛋白，并使用酶聯(lián)免疫試劑盒(EnzymeImmunosorbentAssay，EIA)分別檢測第一步（神經(jīng)組織來源）和第二步（非神

11、經(jīng)組織來源）提取蛋白內(nèi)的P物質(zhì)含量;免疫組化染色L3椎體和/或股骨遠(yuǎn)端檢測P物質(zhì)和NK1受體表達;抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate-resistantacidphosphatasestain，TRAP)復(fù)合NK1受體免疫組化染色觀察干骺端破骨細(xì)胞表達NK1受體情況;分離培養(yǎng)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstemcell，BMSC)，行NK1受體western-blot檢測以及real-timePCR，觀察BMSCs表

12、達NK1受體情況。
　　結(jié)果:模型建立后第3和第6周，OVX組小鼠股骨骨骺、干骺端以及L3椎體SP免疫陽性產(chǎn)物均明顯低于SHAM組，給予雌激素替代治療組SP免疫陽性表達高于OVX組表達。P物質(zhì)陽性物質(zhì)呈片狀或柬狀，位于骨小梁表面或血管周圍。EIA結(jié)果表明第一次蛋白提取物SP含量高于第二次蛋白提取物SP含量，提示SP在神經(jīng)組織表達量高于非神經(jīng)組織，且OVX小鼠脛骨近端干骺端神經(jīng)組織、非神經(jīng)組織以及總中SP含量較SHAM組均明顯降低。

13、免疫組化結(jié)果提示NK1受體可表達在松質(zhì)骨基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，但OVX和SHAM組平均光密度值(meanopticaldensity,MOD)無統(tǒng)計學(xué)差異。免疫組化復(fù)合TRAP染色結(jié)果提示小鼠干骺端松質(zhì)骨表面表達NK1受體的破骨細(xì)胞數(shù)量較少，且各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。融合至80％的原代BMSCs行NK1-R基因(TACR1mRNA)和蛋白水平表達的檢測，結(jié)果表明無論在基因還是蛋白水平，OVX小鼠NK1-R表達均較SHAM降低。OVX+E2組

14、BMSCs表達高于OVX組，但略低于SHAM組小鼠。
　　結(jié)論:松質(zhì)骨內(nèi)神經(jīng)組織SP表達高于非神經(jīng)組織。卵巢切除誘導(dǎo)松質(zhì)骨SP表達下調(diào)。盡管卵巢切除對骨髓基質(zhì)NK1-R表達無明顯影響，但下調(diào)BMSCs細(xì)胞NK1受體表達。雌激素可能調(diào)控BMSCs細(xì)胞NK1-R表達。
　　第三部分阻斷P物質(zhì)信號對卵巢切除后骨質(zhì)琉松小鼠骨量變化的影響
　　背景:骨量的維持依賴于骨微環(huán)境中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的動態(tài)平衡。作為速激肽家族中的重

15、要一員，P物質(zhì)廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，參與疼痛傳導(dǎo)、神經(jīng)炎癥、平滑肌收縮、血管舒縮以及血管形成等重要的生理過程。大量的研究表明P物質(zhì)在調(diào)控骨代謝動態(tài)平衡中起到重要作用。然而，阻斷P物質(zhì)信號對去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松骨量的影響尚不明確，其機制也有待進一步研究。
　　目的:本研究的目的在于使用P物質(zhì)特異性阻斷劑L-703606，觀察阻斷P物質(zhì)信號對去卵巢和卵巢完整小鼠骨量的影響，及其機制。
　　材料與方法:32只9周齡雌性小鼠隨

16、機分為四組:SHAM組、SHAM+L組、OVX組以及OVX+L組，每組8只。SHAM和SHAM+L組小鼠接受假手術(shù)（僅顯露卵巢），而OVX和OVX+L組接受卵巢切除手術(shù)。模型建立3周后，SHAM+L和OVX+L組小鼠接受L-703606連續(xù)3周腹腔注射，SHAM和OVX組接受溶媒——二甲基亞砜連續(xù)3周腹腔注射。采用2×2析因設(shè)計實驗方案，觀察OVX模擬的雌激素缺乏和L-703606阻斷P物質(zhì)信號對骨代謝的主效應(yīng)和交互效應(yīng)。取第三腰椎(3

17、rdlumbarvertebrae，L3)和右側(cè)脛骨行生物力學(xué)測試;取左側(cè)脛骨行micro-CT檢測;取左側(cè)股骨行實時real-timePCR檢測，取右側(cè)股骨行組織學(xué)檢測。
　　結(jié)果:L-703606干預(yù)導(dǎo)致正常和去卵巢小鼠骨礦含量和骨密度降低。Micro-CT結(jié)果提示L-703606導(dǎo)致正常和OVX小鼠松質(zhì)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，具體表現(xiàn)為骨容積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低，而骨小梁分離度增加。但是，L-703606對皮質(zhì)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)

18、參數(shù)，如骨骼總面積、皮質(zhì)骨面積、皮質(zhì)骨面積分?jǐn)?shù)和皮質(zhì)骨厚度，均無明顯影響。生物力學(xué)結(jié)果表明阻斷P物質(zhì)信號導(dǎo)致L3和脛骨力學(xué)性能降低。阻斷P物質(zhì)減少松質(zhì)骨成骨細(xì)胞數(shù)量和類骨質(zhì)容積，增加破骨細(xì)胞數(shù)量，并明顯降低OPG/RANKL的比率。L-703606也下調(diào)干骺端松質(zhì)骨血管形成因子的表達，但對體重、子宮重量以及血清雌激素水平無明顯影響。
　　結(jié)論:阻斷P物質(zhì)信號導(dǎo)致正常和去卵巢小鼠骨量丟失，這一效應(yīng)可能與減少松質(zhì)骨血管形成因子表達相關(guān)