SurKex誘導(dǎo)survivin基因沉默的分子機(jī)理研究.pdf

1、Survivin是調(diào)亡抑制蛋白家族成員,具有調(diào)控有絲分裂和抑制細(xì)胞凋亡的作用。Survivin在大多數(shù)結(jié)束分化的正常組織中均未被檢測到,但在幾乎所有的腫瘤組織中均過量表達(dá),并為腫瘤細(xì)胞生存所必須。因此,survivin破公認(rèn)為是癌癥治療的一個重要靶點(diǎn)。
　　 研究發(fā)現(xiàn),用一正義的短鏈甲基化寡核苷酸與某一基因啟動子區(qū)序列互補(bǔ),可以誘導(dǎo)該基因啟動子區(qū)甲基化而抑制基因轉(zhuǎn)錄。利用這一機(jī)制來抑制病基因的表達(dá),應(yīng)能起到治療疾病的作用。據(jù)此,

2、我們設(shè)計(jì)了一個與survivin基因啟動子區(qū)域互補(bǔ)的22個堿基的田基化脫氧寡核苷酸SurKex,在早期的工作中,我們通過體內(nèi)外的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,SurKex能抑制survivin mRNA和蛋白的表達(dá),并對荷瘤鼠腫瘤生長有抑制作用,且能延長荷瘤鼠的存活時(shí)間。同時(shí),對SurKex作用機(jī)理也進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明,它是通過誘導(dǎo)survivin啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化而導(dǎo)致基因沉默的。
　　 在前期工作的基礎(chǔ)上,本文首先對SurKe

3、x誘導(dǎo)survivin啟動子部位甲基化的作用方式進(jìn)行了更深入的研究,通過亞硫酸氫鈉測序法,確證了SurKex誘導(dǎo)survivin啟動子部位發(fā)生甲基化的方式是靶向、定點(diǎn)誘導(dǎo)。
　　 基因沉默時(shí),與之結(jié)合的組蛋白往往會發(fā)生一些共價(jià)修飾的改變,所以接下來的研究,我們主要考察了SurKex誘導(dǎo)survivin沉默后,與survivin啟動子區(qū)結(jié)合的組蛋白H3、H4上特定的賴氨酸殘基的甲基化水平及H3、H4的乙?；?去乙酰化水平是否發(fā)生相

4、應(yīng)的改變。我們采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù),通過特異性抗體進(jìn)行分析,結(jié)果表明,SurKex作用后,與survivin啟動子區(qū)結(jié)合的組蛋白H3-K9二甲基化、H3-K27三甲基化水平升高;H4乙?；4-K16乙?；浇档?也即去乙酰化水平升高。組蛋白的這些改變,與基因沉默是呈正相關(guān)的。
　　 DNA甲基化和組蛋白的共價(jià)修飾,都是調(diào)控基因表達(dá)的重要表觀遺傳學(xué)生化事件。關(guān)于二者之間的因果關(guān)系,進(jìn)行調(diào)控的先后順序,一直是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域研

5、究的熱點(diǎn)。在我們的實(shí)驗(yàn)中,SurKex作用后,既引起DNA甲基化,又引起組蛋白尾部修飾的改變。它們之間是如何彼此協(xié)作、控制survivin的開或關(guān),更確切地說,是DNA甲基化指導(dǎo)組蛋白共價(jià)修飾的改變,還是組蛋白共價(jià)修飾的改變指導(dǎo)DNA甲基化,是我們接下來的研究要解決的關(guān)鍵問題。我們選用DNA甲基化酶抑制劑5-氮脫氧胞嘧啶核苷(5-Aza-CdR)、組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)和組蛋白甲基化酶抑制劑BIX-01294,分別

6、考察DNA甲基化或組蛋白去乙酰化或甲基化作用被相應(yīng)抑制劑阻斷后,對SurKex效應(yīng)的影響,以此闡明DNA甲基化和組蛋白共價(jià)修飾(去乙?；图谆?在survivin沉默中的因果關(guān)系和調(diào)控順序。具體方法是通過RT-PCR考察survivin mRNA表達(dá)情況、Bisulfite sequencing分析survivin啟動子區(qū)特定CpG甲基化情況及染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)考察與survivin結(jié)合的組蛋白共價(jià)修飾情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,

7、DNA甲基化是survivin沉默中最關(guān)鍵的一步,但組蛋白去乙酰化和甲基化指導(dǎo)DNA甲基化,它們的作用途徑可能與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)有關(guān)。
　　 最后,我們想初步驗(yàn)證對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的推論是否正確。我們用TSA和BIX-01294分別阻斷組蛋白去乙?；图谆?用RT-PCR考察對DNMT1 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明,組蛋白去乙?；徒M蛋白甲基化被相應(yīng)的抑制劑阻斷后,都出現(xiàn)了DNMT1 mRNA表達(dá)的降低。由此

8、可見,組蛋白去乙酰化和甲基化都可能能通過上調(diào)DNMT1 mRNA表達(dá)而影響DNA甲基化。當(dāng)然,這可能只是它們作用途徑中的一個環(huán)節(jié)。
　　 本課題的研究首先確證了SurKex為一種新型的靶向、定點(diǎn)甲基化透導(dǎo)制,它通過誘導(dǎo)survivin基因啟動子區(qū)特定CpG位點(diǎn)甲基化而引起survivin沉默；其次闡明了SurKex在誘導(dǎo)survivin沉默的過程中,除了DNA甲基化之外,組蛋白H3-K9二四基化、H3-K27三甲基化水平升高,組

9、蛋白H4、H4-K16乙酰化水平降低；接著,以SurKex為工具藥,初步闡明了在survivin沉默過程中,DNA甲基化是最關(guān)鍵的一步,但組蛋白共價(jià)修飾的改變(組蛋白去乙酰化和甲基化)是更優(yōu)勢的事件,它指導(dǎo)DNA的甲基化；最后,初步證明組蛋白共價(jià)修飾的改變(組蛋白去乙酰化和甲基化)是通過影響DNMT1 mRNA的表達(dá),來指導(dǎo)DNA甲基化。
　　 本課題的研究不但為抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)提供了新的思路,提供了從表觀遺傳學(xué)角度靶向治療癌癥