羧基化單壁碳納米管對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)的毒性效應(yīng)研究.pdf

1、目的:(1)明確羧基化單壁碳納米管(carboxylated single-walledcarbon nanotubes，SWCNT-COOH)的物理化學(xué)性質(zhì);(2)研究SWCNT-COOH不同給藥方式對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)的毒性作用，并探討其可能的毒性效應(yīng)機(jī)制，為SWCNT-COOH在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用提供毒性依據(jù)。
　　方法:(1)通過(guò)濃混酸處理（H2SO4∶HNO3=3∶1，V/V）、超聲剪切、透析和超濾等手段對(duì)SWCNT-CO

2、OH進(jìn)行氧化、剪切和純化，以激光拉曼光譜儀（Raman）、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis）、透射電子顯微鏡(TEM)、激光納米粒度儀(LPSA)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)對(duì)SWCNT-COOH的純度、表面形貌、粒徑分布、金屬雜質(zhì)含量等方面進(jìn)行表征。(2)設(shè)立6個(gè)藥物濃度組，分別為未去膜組（空白對(duì)照、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L）與去膜組(空白對(duì)照、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/

3、L)，從8hpf開(kāi)始染毒，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱控光培養(yǎng)至72hpf。ELISA法檢測(cè)SWCNT-COOH對(duì)斑馬魚(yú)胚胎IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)與骨骼發(fā)育相關(guān)基因BMP2b、BMP4、runx2a及runx2b mRNA的相對(duì)表達(dá)量。(3)4dpf的斑馬魚(yú)被分為4個(gè)組，分別為空白對(duì)照、40mg/L、80 mg/L和160 mg/L，以SWCNT-COOH進(jìn)行染毒，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱控光連續(xù)培養(yǎng)至6

4、 dpf。采用TEM、HE染色及熒光蛋白消化法觀察評(píng)價(jià)SWCNT-COOH對(duì)6dpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)消化道的影響。(4)將48 hpf的MPO品系斑馬魚(yú)幼魚(yú)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和3個(gè)劑量組:D/10、D/3、D(D=40ngSWCNT-COOH)，通過(guò)卵黃囊注射SWCNT-COOH進(jìn)行染毒，觀察SWCNT-COOH對(duì)斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞形成的影響，直到6dpf。以同樣的方法將48 hpf的MPO品系斑馬魚(yú)幼魚(yú)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和3個(gè)

5、劑量組，并設(shè)置3個(gè)觀測(cè)時(shí)間:注射后4小時(shí)(4 hpi)、注射后20小時(shí)(20 hpi)和注射后24小時(shí)(4 hpi)，觀察SWCNT-COOH誘發(fā)的斑馬魚(yú)炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)純化后得到了分散性好、穩(wěn)定、粒度均一性好和金屬雜質(zhì)含量低的SWCNT-COOH。(2)與空白對(duì)照組相比，SWCNT-COOH對(duì)去膜和未去膜斑馬魚(yú)胚胎炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的含量均無(wú)影響;SWCNT-COOH染毒后，未去膜組中斑馬魚(yú)胚胎基因

6、BMP2b、BMP4、runx2a和runx2b mRNA的表達(dá)水平未發(fā)生改變，去膜組中上述基因mRNA略下調(diào)，但與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)與空白對(duì)照組相比，各染毒組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)胃腸道上皮絨毛均出現(xiàn)不同程度的脫落與腫脹，其中高劑量組受影響程度最大，腸道內(nèi)可見(jiàn)團(tuán)聚的SWCNT-COOH;空白對(duì)照組的胃腸道上皮絨毛排列整齊完好，而高劑量組(160mg/L)則出現(xiàn)絨毛脫落現(xiàn)象。(4)與溶劑對(duì)照組比較，各處理組定量評(píng)價(jià)區(qū)域中性粒細(xì)

7、胞數(shù)量差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在4hpi、20 hpi和24 hpi，與溶劑對(duì)照組比較，各處理組定量評(píng)價(jià)區(qū)域中性粒細(xì)胞數(shù)量均沒(méi)有差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:(1)建立了純化和表征SWCNT-COOH的方法。(2)在劑量范圍內(nèi)，SWCNT-COOH對(duì)斑馬魚(yú)胚胎無(wú)致炎作用和骨毒性影響，預(yù)示SWCNT-COOH潛在的胚胎毒性較低或基本無(wú)毒。(3)揭示了SWCNT-COOH對(duì)斑馬魚(yú)胃腸道具有潛在的毒性影響，