外切糖苷酶清除人體器官血型抗原的實驗研究.pdf

1、目的:實驗研究外切糖苷酶清除人的紅細胞及肝臟血型抗原，探討人體器官血型轉(zhuǎn)換的可行性;
　　方法:
　　一、綠色咖啡豆來源α-半乳糖苷酶清除人的細胞表面的B型抗原;
　　由于α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度是25℃，最適宜的ph為6.5，反應(yīng)的最佳溶液為磷酸鉀鹽緩沖液。實驗不同稀釋度的α-半乳糖苷酶清除紅細胞表面的血型抗原，篩選對酶清除血型抗原的最適反應(yīng)酶濃度，10倍稀釋的α-半乳糖苷酶處理磷酸鉀鹽溶液稀釋的懸浮紅細胞60m

2、in，流式細胞儀分析α-半乳糖苷酶對紅細胞B抗原清除效果;在不同溫度條件下(4℃、25℃)，對比觀察酶的活性變化;
　　采用肝移植手術(shù)中病肝為實驗對象，建立肝臟的灌注模型。用UW液+/-α-半乳糖苷酶灌注離體肝臟標本，灌注液保存4h，免疫熒光技術(shù)分析肝組織血型抗原的變化，從器官水平探討α-半乳糖苷酶體對肝臟B血型抗原的清除效果.實驗組和對照組，組內(nèi)不同時間段的血型抗原的水平進行單因素方差分析，對比組內(nèi)血型抗原水平差異是否有統(tǒng)計學(xué)意

3、義;組間相同時間段血型抗原水平進行獨立樣本資料的t檢驗，對比組間同一時間點血型抗原水平差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　二、基因重組的α-N-乙酰半乳糖苷酶清除人的紅細胞表面的A型抗原;
　　制備5％的A型紅細胞懸液，經(jīng)不同稀釋度的α-N-乙酰半乳糖胺酶處理60min，流式細胞儀分析，繪制不同稀釋度的酶對血型抗原清除率的曲線，篩選對酶清除血型抗原的最適反應(yīng)酶濃度;在不同溫度條件下(4℃、37℃)，對比觀察酶的活性變化;
　　

4、采用肝移植手術(shù)中病肝為實驗對象，用UW液+/-α-N-乙酰半乳糖苷酶灌注離體A型肝臟標本，灌注液保存4h，免疫熒光技術(shù)分析肝組織血型抗原的變化，從器官水平探討α-N-乙酰半乳糖苷酶對肝臟A血型抗原的清除效果。實驗組和對照組，組內(nèi)不同時間段的血型抗原的水平進行單因素的方法分析，對比組內(nèi)血型抗原水平差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義;組間相同段血型抗原水平進行獨立樣本資料的t檢驗，對比組間同一時間點血型抗原水平差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:

5、r>　　(1)不同稀釋度的α-半乳糖苷酶對紅細胞表面B抗原的清除效率不同，10倍稀釋度的α-半乳糖苷酶清除B抗原效率最高;低溫降低了α-半乳糖苷酶清除血型抗原的效率。
　　用UW液+α-Gal灌注離體的B血型肝臟標本，低溫保存4h，肝臟B抗原的含量明顯減少。實驗組內(nèi)不同時間血型抗原水平經(jīng)過ANOVA分析，P值＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組肝組織B抗原平均水平1h減少至58％，2h為10％，4h為4％，而對照組血型抗原水平未見

6、明顯的變化;
　　(2)不同稀釋度的α-NAGA對紅細胞A型抗原的清除效率不同，100倍稀釋的α-NAGA可以較好的清除紅細胞的A抗原;對比4℃與37℃條件下，酶對血型抗原的清除效果，低溫可降低酶活性，在4℃條件下，α-NAGA仍具有清除紅細胞表面29％血型抗原能力;
　　用UW液+α-NAGA灌注離體的A血型肝臟標本，灌注結(jié)束低溫保存4h，與灌注前相比，灌注后的肝臟A血型抗原的含量明顯降低。實驗組內(nèi)不同時間血型抗原水平經(jīng)過

7、ANOVA分析，P值＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組肝組織A抗原平均水平，1h減少為46％、2h為15％、4h為3％;
　　結(jié)論:
　　(1)α-半乳糖苷酶可有效清除紅細胞表面B血型抗原，實現(xiàn)B→O的血型轉(zhuǎn)換;用UW液+α-半乳糖苷酶體外灌注離體B型肝臟標本，肝組織內(nèi)血型抗原的含量明顯降低，肝組織血型抗原清除后，但并未達到不可檢測的水平;
　　(2)α-N-乙酰半乳糖苷酶可有效清除紅細胞表面A血型抗原，實現(xiàn)A→O的