HDAC4磷酸化水平對腦缺血后血管新生的影響及其機制探討.pdf

1、研究背景與目的:
　　腦血管疾病、心臟疾病和惡性腫瘤是人類死亡的三大主要疾病。腦卒中發(fā)生后,常導(dǎo)致患者死亡或遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān),危害甚大。流行病學(xué)資料數(shù)據(jù)顯示,在全部腦血管疾病中,缺血性腦卒中約占到80％。針對缺血性腦卒中目前仍沒有很好的治療手段,且效果有限。有學(xué)者提出如能盡早促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成恢復(fù)局部血流,不僅有利挽救半影區(qū)的神經(jīng)元,而且為其后功能修復(fù)中的神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖和功能重塑等提供良好

2、的微環(huán)境,最大限度改善預(yù)后。因此如何盡早恢復(fù)血流促進(jìn)新生血管形成對于缺血性卒中的治療具有重大意義。
　　血管新生(angiogenesis)是指在原有血管基礎(chǔ)上芽生出新的血管、廣泛重建后形成穩(wěn)定血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜過程。血管新生受到多種生長因子共同調(diào)控,是多種相關(guān)基因多步驟協(xié)同作用的共同結(jié)果。缺氧誘導(dǎo)因子-l(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial

3、 growth factor, VEGF)是研究較早的廣泛應(yīng)用于缺血性疾病研究的調(diào)控因子。HIF-VEGF信號通路是缺血缺氧后調(diào)節(jié)血管新生的重要機制之一,但其調(diào)控血管新生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步闡明。
　　表觀遺傳學(xué)(epigenetics)修飾在血管新生調(diào)控過程中也扮演了非常重要的角色。組蛋白修飾是表觀遺傳修飾中的一種重要的調(diào)節(jié)方式,其中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙

4、?；?histone deacetylases, HDACs)在組蛋白修飾過程中不可或缺。在組織發(fā)育和腫瘤血管生成研究中發(fā)現(xiàn),活化的關(guān)鍵 HDACs對于血管新生的發(fā)生和完善起到了關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。HDAC4(histone deacetylase4)是HDACs家族成員之一,存在多個磷酸化位點。研究發(fā)現(xiàn)HDAC4蛋白磷酸化后能夠從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì),從而激活下游與血管相關(guān)基因的表達(dá)。然而在發(fā)生缺血性腦卒中時磷酸化HDAC4是否也參與調(diào)控

5、血管的新生其調(diào)控機制如何,其與已知的 HIF-VEGF信號通路的又是如何相互影響目前尚不得知。
　　據(jù)此,本研究通過觀察體內(nèi)外缺血缺氧時信號通路分子 HIF-1α、VEGFa、HDAC4及 P-HDAC4632蛋白等變化規(guī)律,初步探討 HDAC4磷酸化水平對腦缺血后血管新生過程的可能影響及其機制,以期深入理解腦卒中后血管新生的分子調(diào)控機制,并為腦卒中等缺血性疾病的修復(fù)治療提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1

6、.體內(nèi)實驗
　　1.1、根據(jù)缺血再灌注不同時間點分為24h和48h組。制作大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型(參考Longa法),分別于缺血再灌注后24h、48h分批處死各組大鼠,取腦組織標(biāo)本待檢。
　　1.2、腦組織標(biāo)本冰凍切片行免疫組織化學(xué)熒光染色分別檢測24h和48h缺血再灌注后CD31表達(dá),比較不同時間點缺血側(cè)及健側(cè)皮質(zhì)微血管密度,以了解缺血區(qū)血管新生情況

7、。
　　1.3、采用Western blot法分別檢測24h和48h缺血再灌注后大腦缺血皮質(zhì)和健側(cè)皮質(zhì)中HIF-1α、VEGFa、HDAC4和P-HDAC4632蛋白表達(dá)水平。
　　2.體外實驗
　　2.1、構(gòu)建HMEC-1細(xì)胞缺氧和藥物干預(yù)模型,隨機分為常氧組(N)、缺氧組(H)、磷酸化酶抑制劑干預(yù)組(H+G)。
　　2.2、采用Western blot法分別檢測不同組別細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGFa、HDAC

8、4和P-HDAC4632蛋白表達(dá)水平。
　　2.3、采用實時熒光定量PCR檢測不同組別細(xì)胞內(nèi)VEGF下游成血管相關(guān)基因RCAN2表達(dá)變化。
　　2.4、觀察不同組別HMEC-1細(xì)胞成管能力變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗
　　1.1、大鼠腦中動脈腦經(jīng)梗塞后均出現(xiàn)程度不等的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn),包括對側(cè)肢體偏癱、眼瞼下垂、行走時原地轉(zhuǎn)圈和向?qū)?cè)傾斜、提尾向?qū)?cè)側(cè)身等一系列異常反應(yīng);TTC染色見右側(cè)大腦中動

9、脈供血區(qū)域呈蒼白色,而周圍正常腦組織呈紅色;上述表現(xiàn)均提示腦缺血模型制作成功。
　　1.2、免疫組織化學(xué)熒光染色分別檢測24h和48h缺血再灌注后CD31表達(dá),結(jié)果顯示缺血側(cè)皮質(zhì)微血管密度明顯多于健側(cè)皮質(zhì),且缺血再灌注48h后缺血側(cè)半暗區(qū)新生微血管密度顯著高于再灌注24h后。
　　1.3、Western blot檢測結(jié)果表明缺血再灌注24h后,缺血側(cè)半暗區(qū)皮質(zhì)HIF-1α和VEGFa蛋白表達(dá)明顯要高于健側(cè)皮質(zhì);但是隨著灌注的

10、時間的延長至48h后,缺血側(cè)半暗區(qū)皮質(zhì)P-HDAC4632蛋白也明顯高于健側(cè)皮質(zhì);其中各組別總HDAC4蛋白表達(dá)水平無明顯差異性。
　　2.體外實驗
　　2.1、在體外使用缺氧條件(1% O2濃度、5%CO2濃度)培養(yǎng)HMEC-1(人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞),其中一組為單純?nèi)毖踅M(H組),另一組使用藥物G6976預(yù)處理細(xì)胞30min后再缺氧培養(yǎng)(H+G組),均以常氧組(21% O2濃度、5%CO2濃度)為對照組。
　　2.2

11、、缺氧或藥物刺激12h后,各組細(xì)胞在缺氧條件下無論是否添加磷酸化酶抑制劑G6976干預(yù),Western blot檢測結(jié)果表明HIF-1α和VEGFa蛋白均高表達(dá)。在各組當(dāng)中HDAC4總蛋白表達(dá)水平無明顯差異性,但P-HDAC4632蛋白與HIF-1α和VEGFa蛋白表達(dá)情況并不一致,H組P-HDAC4632明顯高表達(dá)于常氧組,而H+G組P-HDAC4632蛋白表達(dá)減少。
　　2.3、實時熒光定量 PCR檢測結(jié)果表明,相比常氧對照組

12、,單純?nèi)毖踅MRCAN2基因明顯高表達(dá);然而使用磷酸化酶抑制劑G6976預(yù)處理之后,RCAN2基因表達(dá)水平明顯減少。
　　2.4相比較于常氧組,H組HMEC-1細(xì)胞成管能力明顯增強;而H+G組細(xì)胞成管受到限制。
　　結(jié)論:
　　本研究的體內(nèi)腦缺血動物模型實驗結(jié)果顯示,腦缺血后缺血皮質(zhì)區(qū)微血管密度增多,缺血皮質(zhì)區(qū)HIF-1α和VEGFa表達(dá)明顯上調(diào),同時伴隨HDAC4蛋白磷酸化水平的明顯變化;進(jìn)一步通過體外血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧