黑尾葉蟬NcPGRP基因克隆及RDV感染對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的影響.pdf

1、黑尾葉蟬Nephotettix cincticeps(Uhler)屬于半翅目葉蟬科，是我國(guó)水稻上重要害蟲之一。黑尾葉蟬除刺吸取食水稻汁液為害外，還能傳播水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)，對(duì)水稻造成了嚴(yán)重危害。昆蟲先天免疫是昆蟲防御病原微生物的首道防線，而肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)則是昆蟲免疫系統(tǒng)中的重要免疫識(shí)別蛋白，在昆蟲產(chǎn)生抗菌肽等免疫物質(zhì)的

2、過(guò)程中起到重要調(diào)控作用。黑尾葉蟬作為RDV的介體昆蟲，目前關(guān)于RDV對(duì)黑尾葉蟬免疫能力影響的相關(guān)報(bào)道較少。本文通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，得到數(shù)個(gè)黑尾葉蟬PGRPs基因，篩選出其中轉(zhuǎn)錄水平被RDV所抑制的PGRPs，通過(guò)基因克隆及原核表達(dá)研究NcPGRP分子特性和蛋白特性，利用定量PCR和RNAi技術(shù)研究NcPGRP在黑尾葉蟬免疫反應(yīng)中的功能。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.以各常見(jiàn)昆蟲PGRP基因作為參考序列，通過(guò)本地blast從黑尾葉蟬轉(zhuǎn)錄組

3、數(shù)據(jù)中篩選到12個(gè)E值(E-Value)較高的PGRPs基因。利用定量PCR檢測(cè)感染RDV黑尾葉蟬體內(nèi)各PGRPs的表達(dá)量，篩選出3個(gè)轉(zhuǎn)錄水平會(huì)受到RDV抑制的PGRPs基因。
　　2.NcPGRP基因克隆結(jié)果顯示，NcPGRP基因開放閱讀框大小為552 bp，預(yù)測(cè)蛋白大小約19.9 kDa，等電點(diǎn)(pI)為7.29，N端無(wú)信號(hào)肽，15～34位氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域，含3個(gè)鋅離子結(jié)合/酰胺酶催化位點(diǎn)，1個(gè)二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚

4、糖識(shí)別位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NcPGRP與其他昆蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。組織分布研究表明，NcPGRP基因的mRNA在各組織中均有表達(dá)，且頭部表達(dá)量最高。
　　3.利用黑尾葉蟬NcPGRP基因序列構(gòu)建重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌Rosetta菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示NcPGRP蛋白大小約20 kDa。利用其氨基酸序列制作多肽抗體。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明黑尾葉蟬體內(nèi)NcPGRP蛋白的表達(dá)量很低。
　　4.利用顯微注射

5、技術(shù)對(duì)黑尾葉蟬進(jìn)行病原細(xì)菌感染，定量PCR結(jié)果顯示，NcPGRP的轉(zhuǎn)錄水平在大腸桿菌Escherichia coli DH5。及藤黃微球菌Micrococcus luteus感染葉蟬后顯著上調(diào)，且兩種病原細(xì)菌上調(diào)NcPGRP轉(zhuǎn)錄水平的能力沒(méi)有顯著差異。成蟲羽化后NcPGRP轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升，在羽化后第10天達(dá)到峰值，后開始逐漸下降。黑尾葉蟬在取食感染水稻普通矮縮病毒RDV的水稻后，NcPGRP轉(zhuǎn)錄水平受抑制。使用dsPGRP對(duì)黑尾葉蟬進(jìn)