恐傷孕鼠對(duì)其仔鼠早期長(zhǎng)骨發(fā)育的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、中醫(yī)理論認(rèn)為腎主藏精，為先天之本，腎精主生長(zhǎng)、發(fā)育及生殖；腎主骨，腎所藏之精能生髓，髓能養(yǎng)骨，據(jù)此我們提出了腎主骨生長(zhǎng)發(fā)育的觀點(diǎn)。并分別從理論探討和實(shí)驗(yàn)研究?jī)煞矫孢M(jìn)行了研究。 目的: 本實(shí)驗(yàn)采用“恐傷孕鼠”的方法復(fù)制腎精虧虛模型，研究孕鼠腎虛對(duì)其仔鼠早期長(zhǎng)骨發(fā)育的影響及機(jī)制。 方法: ①本實(shí)驗(yàn)采用3月齡SD(Sprague—Dawley)大鼠，雌性30只，雄性15只，將其按2：1的比例合籠配對(duì)。受孕后的雌

2、鼠用隨機(jī)分為正常組、模型組和補(bǔ)腎組，每組各10只。自懷孕第一天起，模型組和補(bǔ)腎組每日上、下午用貓恐嚇孕鼠各2小時(shí)直至其分娩，在仔鼠出生后20天進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。自懷孕第一天起，補(bǔ)腎組每日予中藥補(bǔ)腎填精方煎劑2ml/100g體重灌胃，正常組及模型組每日予生理鹽水2ml/100g體重灌胃，直至孕鼠臨產(chǎn)。 ②記錄孕鼠產(chǎn)子數(shù)，評(píng)估其生育力。記錄仔鼠開(kāi)眼、出牙、張耳、被毛生長(zhǎng)的時(shí)間；測(cè)量仔鼠出生至20天內(nèi)每隔4天的體重及身長(zhǎng)，計(jì)算各時(shí)段增長(zhǎng)值

3、，各組間比較判斷仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。 ③仔鼠20日齡時(shí)每窩隨機(jī)抽取1-2只，斷頭處死。從髖關(guān)節(jié)處切下右下肢，仔細(xì)清除所有肌肉和相連組織，去除腓骨，剩下脛骨。取右脛骨近端1/3，放入10％中性甲醛中固定1周，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，5um厚連續(xù)縱向切片；20日齡時(shí)，每組隨機(jī)抽取一只，斷頭處死，迅速分離右側(cè)脛骨，切取1mm3骨組織置入戊二醛固定液固定。分別在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察各組仔鼠出生后20天脛骨干骺端生長(zhǎng)板的組織形態(tài)學(xué)改變

4、。 ④仔鼠20日齡時(shí)每組隨機(jī)抽取5個(gè)右脛骨近端標(biāo)本，進(jìn)行切片檢測(cè)。原位雜交法測(cè)定仔鼠出生后20天脛骨干骺端TGF—β mRNA表達(dá)。 ⑤仔鼠出生后20天，每窩隨機(jī)抽取1-2只，每組共抽取15只，斷頭取血，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清IGF-1、BALP含量。 ⑥仔鼠出生后20天，每窩隨機(jī)抽取3只或6只斷頭取血?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲腺原氨酸(FT4)及促甲狀腺激素(TSH)的

5、含量。⑦每組抽取30張右脛骨近端標(biāo)本切片免疫組化SABC法觀察仔鼠出生20天生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞Bcl-2/bax的表達(dá)。 結(jié)果: ①孕鼠產(chǎn)子數(shù)、仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀況：模型組孕鼠的平均每胎生產(chǎn)數(shù)低于正常組和補(bǔ)腎組(P＜0.01)。從出生到出生后第20天內(nèi)，模型組仔鼠平均體重顯著低于正常組和補(bǔ)腎組；從出生后第8天起，模型組仔鼠平均身長(zhǎng)顯著短于正常組和補(bǔ)腎組；模型組各時(shí)段平均體重、身長(zhǎng)增長(zhǎng)情況明顯落后；模型組仔鼠出牙及被毛生長(zhǎng)的時(shí)間

6、略晚于補(bǔ)腎組和正常組。 ②仔鼠生后20天生長(zhǎng)板形態(tài)學(xué)改變：模型組仔鼠生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)紊亂，增殖區(qū)軟骨細(xì)胞發(fā)育不良，成骨作用減弱，骨量明顯減少。電鏡下模型組仔鼠生長(zhǎng)板增殖區(qū)內(nèi)多個(gè)視野下軟骨細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)異常，部分細(xì)胞核固縮。正常組與補(bǔ)腎組仔鼠生長(zhǎng)板形態(tài)學(xué)則無(wú)明顯改變。 ③仔鼠生后20天時(shí)TGF—β在干骺端的表達(dá)：陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞呈深藍(lán)色，定位于細(xì)胞漿；陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度采用平均光度進(jìn)行定量分析。模型組平均光度較正常組和補(bǔ)腎組下降，正常組

7、和補(bǔ)腎組相比無(wú)差異。 ④仔鼠出生20天斷頭取血，血清IGF-1、BALP含量：模型組顯著降低(P＜0.05)，正常組和補(bǔ)腎組相比無(wú)差異。 ⑤仔鼠生后20天斷頭取血，血清FT3、FT4，TSH的含量：模型組仔鼠血清FT4的含量低于正常組(P＜0.05)，血清FT3，TSH的含量與正常組相比無(wú)差異。補(bǔ)腎組仔鼠血清FT3，F(xiàn)T4、TSH的含量與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ⑥仔鼠生后20天免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒，Bc

8、l-2表達(dá)位于細(xì)胞漿；bax表達(dá)位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。Bcl-2主要在靜止區(qū)、增殖區(qū)表達(dá)， bax主要在肥大區(qū)表達(dá)，各組陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率情況比較：模型組仔鼠Bcl-2表達(dá)較正常組和補(bǔ)腎組顯著下降(p＜0.05)；模型組仔鼠bax表達(dá)較正常組和補(bǔ)腎組表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)。 結(jié)論: ①模型組孕鼠的每胎生產(chǎn)數(shù)低于正常組和補(bǔ)腎組；仔鼠從出生到出生后第20天內(nèi)，平均體重、平均身長(zhǎng)、各時(shí)段平均體重、身長(zhǎng)增長(zhǎng)情況、出牙、被毛生長(zhǎng)時(shí)間

9、較補(bǔ)腎組和正常組明顯落后，結(jié)合恐傷腎的病因病機(jī)，說(shuō)明模型組孕鼠表現(xiàn)出生殖功能減退，存在腎精虧虛；同時(shí)，其仔鼠也存在先天腎虛，故其機(jī)體發(fā)育遲緩。 ②模型組仔鼠脛骨生長(zhǎng)板組織學(xué)改變、增殖區(qū)軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，提示其軟骨細(xì)胞增殖未達(dá)到正常水平，生長(zhǎng)板生長(zhǎng)速度降低，軟骨內(nèi)成骨緩慢；成骨區(qū)成骨量明顯減少。 ③模型組仔鼠脛骨生長(zhǎng)板TGF—β在增殖層和肥大層受到抑制，表達(dá)減少，導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨形成緩慢，影響長(zhǎng)骨生長(zhǎng)。 ④腎虛致

10、骨發(fā)育障礙的分子機(jī)制可能為：模型組仔鼠存在先天腎虛、長(zhǎng)骨發(fā)育障礙和血清TH水平下降，IGF-1含量減少。結(jié)合現(xiàn)代研究認(rèn)為存在下丘腦—垂體—甲狀腺軸的功能紊亂，腎虛與IGF-1的含量密切相關(guān)，推測(cè)TH降低影響IGF-1的表達(dá)從而影響生長(zhǎng)板的生長(zhǎng)障礙；模型組仔鼠存在先天腎虛、長(zhǎng)骨發(fā)育障礙、生長(zhǎng)板TGF—β表達(dá)下降，同時(shí)血清IGF-1含量減少，伴隨著B(niǎo)cl-2基因表達(dá)的下調(diào)。結(jié)合現(xiàn)代腎虛對(duì)IGF-1、TGF—β表達(dá)的影響，Bcl-2基因的表達(dá)