電磁場對細(xì)胞基因表達(dá)影響研究.pdf

1、低強(qiáng)度環(huán)境電磁場(主要是工頻磁場和射頻電磁場)暴露的生物學(xué)效應(yīng)及其作用機(jī)制至今還不清楚.為研究低強(qiáng)度電磁場暴露對細(xì)胞基因表達(dá)的影響,本學(xué)位論文主要以MCF-7細(xì)胞為研究模型,采用重復(fù)基因芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),分析工頻磁場和射頻電磁場輻照對MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,期望篩選獲得兩類電磁場輻照后的差異表達(dá)基因,然后利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)驗(yàn)證這些電磁場候選反應(yīng)基因,并比較分析兩類電磁場對細(xì)胞基因表達(dá)影響

2、的異同.考慮到現(xiàn)今對人類基因組了解并不全面,本學(xué)位論文同時(shí)以模式生物釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為輔助研究對象,分析兩類電磁場輻照對釀酒酵母細(xì)胞全基因表達(dá)的影響,為MCF-7細(xì)胞的研究提供指導(dǎo)和補(bǔ)充,從而期望構(gòu)建出真核細(xì)胞對電磁場反應(yīng)的核心機(jī)制,為后續(xù)工作打下基礎(chǔ). 第一部分:工頻磁場對MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)的影響 為研究工頻磁場對MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,本研究將體外傳代培養(yǎng)的MC

3、F-7細(xì)胞隨機(jī)分為2組,并接受0.4 mT的50Hz磁場連續(xù)輻照和假輻照24 h,然后利用Affymetrix公司的人類基因組芯片U133A進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平分析,進(jìn)而用MAS 5.0.軟件和DMT 3.0軟件分析芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).結(jié)果顯示,MCF-7細(xì)胞受50 Hz磁場輻照后,有30個(gè)100﹪一致變化的候選差異基因.為驗(yàn)證這些候選基因,我們進(jìn)一步采用Real-time RT-PCR分析輻照前后特定基因表達(dá)的變化情況.6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,M

4、CF-7細(xì)胞受50 Hz磁場輻照后,SCNNlA基因和METTL3基因被顯著性上調(diào)(P<0.05),GPR137B基因被顯著性下調(diào)(P<0.05);而其他基因則未發(fā)生顯著性改變(P>0.05).因此,在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下,我們檢測到50 Hz工頻磁場對MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)的微弱變化,并確定TMCF-7細(xì)胞的3個(gè)50 Hz工頻磁場反應(yīng)基NSCNN1A、GPRl37B和METIL3.這些MCF-7細(xì)胞工頻磁場反應(yīng)基因改變的生物學(xué)意義還有待于進(jìn)一

5、步研究. 第二部分:射頻電磁場對McF-7細(xì)胞基因表達(dá)的影響 為研究射頻電磁場對MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,本研究將體外傳代培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞隨機(jī)分為4組,并接受比吸收率為2.0和3.5 W/kg的GSM 1800 MHz射頻電磁場間斷輻照(5 min開/10 min關(guān))和假輻照24 h,然后利用U133A基因芯片進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平分析.芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)MAS 5.0軟件和DMT3.0軟件分析顯示,MCF-7細(xì)胞受比吸

6、收率為2.O和3.5 W/kg的射頻電磁場輻照后,分別有0個(gè)和5個(gè)100﹪一致變化的候選差異基因.為驗(yàn)證這些候選基因,我們進(jìn)一步采用Real-time RT-PCR分析輻照前后候選基因表達(dá)的變化情況 6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這些候選基因在各重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間有微小變化,但變化不一致,且無顯著性差異(P>0.05),說明這些基因未能得到Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證.因此,在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下,我們未能檢測到GSM 1800 Mnz射頻電磁

7、場對MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)的明顯影響. 第三部分:電磁場對模式生物釀酒酵母細(xì)胞基因表達(dá)的影響 為研究電磁場對釀酒酵母細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,篩選模式生物可能的電磁場反應(yīng)基因,以指導(dǎo)電磁場對人體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄影響的研究,本研究將靜止培養(yǎng)的酵母細(xì)胞隨機(jī)分為4組,并接受0.4 mT的50 Hz-V頻磁場連續(xù)輻照和假輻照6 h,或接受比吸收率為3.5 W/kg的GSM 1800 MI-Iz射頻電磁場間斷輻照(5 min開/10 m

8、in關(guān))和假輻照6 h,然后利用Affymetrix公司酵母基因組芯片S98進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄水平分析.芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GCOS 1.0軟件和DMT 3.0軟件進(jìn)行分析.結(jié)果顯示,酵母細(xì)胞受工頻磁場和射頻電磁場輻照后,分別有3個(gè)和40個(gè)100﹪一致變化的候選差異基因.為驗(yàn)證這兩類電磁場響應(yīng)的候選基因,我們進(jìn)一步采用Real-time RT-PCR分析輻照前后候選基因表達(dá)的變化情況.6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酵母細(xì)胞受50 Hz磁場輻照后,3個(gè)候

9、選基因在各重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間有微小變化,但變化不一致,且無顯著性差異(P>0.05),說明這些基因未能得到Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證;酵母細(xì)胞受射頻電磁場輻照后,SMC3基因和AQY2(m)基因被顯著性上調(diào)(P<0.05),HAL9基因、YAKl基因和一個(gè)功能未知基因(ORF:YJL171C)被顯著性下調(diào)(P<0.05),其他基因則未發(fā)生顯著性改變(P>0.05),說明這些基因未能得到Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證

10、.此外,通過同源性基因分析,本研究找到了SMC3基因和YAKl基因的人同源性基因. 基于以上的研究結(jié)果及分析討論,本文得出以下結(jié)論: 1. 在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下,未能檢測到SAR為2 W/kg、3.5 W/kg的射頻電磁場輻照MCF-7細(xì)胞24 h引起的基因表達(dá)變化;未能檢測到0.4 mT的工頻磁場輻照釀酒酵母細(xì)胞6 h引起的基因表達(dá)變化. 2. 在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下,檢測到0.4 mT的工頻磁場輻照MCF-7細(xì)胞24 h引

11、起的基因表達(dá)的微弱影響,并確定了SCNN1A基因、GRP137B基因和METTL3基因?yàn)楣ゎl磁場反應(yīng)基因. 3. 在本實(shí)驗(yàn)條件下,檢測到SAR為3.5 W/kg射頻電磁場輻照釀酒酵母細(xì)胞6 h引起的基因表達(dá)的微弱影響,確定了SMC3基因、AQY2(m)基因、HAL9基因、YAK1基因和一個(gè)功能未知基因(ORF:YJL171C)為射頻電磁場反應(yīng)基因,并找到了SMC3基因和YAK1基因的人同源性基因. 4. 以上結(jié)果說明,本

12、論文采用的兩類電磁場對MCF-7和酵母細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄影響較弱,提示這細(xì)胞對兩類電磁場輻照的反應(yīng)性低,或產(chǎn)生了適應(yīng)性反應(yīng).當(dāng)然,也可能是當(dāng)前的基因芯片技術(shù)存在一些局限性,不能靈敏地反映電磁場這種弱物理因素對細(xì)胞基因表達(dá)的影響. 本學(xué)位論文的主要?jiǎng)?chuàng)新: 科學(xué)方面: 1. 從全基因組轉(zhuǎn)錄水平揭示工頻磁場和射頻電磁場對MCF-7細(xì)胞和釀酒酵母細(xì)胞的影響不明顯. 2. 首次確定了SCNN1A基因、GRP137B基

13、因和METTL3基因?yàn)镸CF-7細(xì)胞的工頻磁場反應(yīng)基因;SMC3基因、AQY2(m)基因、HAL9基因、YAK1基因和一個(gè)功能未知基因?yàn)獒劸平湍讣?xì)胞的射頻電磁場反應(yīng)基因.利用生物信息學(xué)分析確定了SMC3基因和YAK1基因的人同源性基因. 方法學(xué)方面: 1. 本學(xué)位論文結(jié)合高通量的基因芯片技術(shù)和熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù),首次系統(tǒng)地從轉(zhuǎn)錄組水平研究了工頻磁場和射頻電磁場對細(xì)胞基因表達(dá)的影響,并試圖比較兩類電磁場對細(xì)胞基因