腸出血型大腸埃希菌O157-H7 EspF蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡功能研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 腸出血型大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是一種新現(xiàn)腸道傳染病致病菌，能引起出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)和血栓性血小板減少性紫癜（Thrombotic thromobocytopenie porpura, TTP）等。1

2、983年，Riley等首次報道了美國EHEC O157∶H7引起的嚴重食源性疾病——出血性結(jié)腸炎。此后，由EHEC O157∶H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)在世界范圍內(nèi)不斷發(fā)生。1986年，我國首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到EHEC O157∶H7，已有十余個省份從食品、家畜家禽和腹瀉患者糞便中分離到該菌。目前，EHEC O157∶H7的感染呈暴發(fā)流行趨勢，具有較強的傳染性與致病性，對人類健康構(gòu)成極大威脅，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。

3、r>　　 EHEC O157∶H7的致病作用主要通過產(chǎn)生志賀樣毒素(STX)和細菌對腸黏膜上皮細胞黏附-抹去損傷（attaching and effacing lesion，A/E損傷）完成。O157∶H7能產(chǎn)生致死性志賀毒素(Stx)，由前噬菌體上的slt基因編碼，是產(chǎn)Vero毒素大腸埃希菌（Vcrocytotoxin-producing E.coli，VTEC）區(qū)別于其它大腸桿菌的顯著特點。引起A/E損傷的主要毒力基因位于染色體腸

4、細胞脫落位點(the locus of enterocyteeffacement，LEE)毒力島。LEE毒力島由5個操縱子組成，編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)、轉(zhuǎn)位蛋白(EspA，EspB，and EspD)、效應(yīng)蛋白(Tir, EspG，EspF，Map和EspH)、緊密黏附素(intimin)、分子伴侶(CesAB，CesD，CesD2，CesF和CesT)和調(diào)控子(Ler，GrlA和GrlR)等。esp基因位于LEE4操縱子末端，編

5、碼分泌效應(yīng)蛋白EspF（EHEC-secreted protein F）。目前，EHEC O157∶H7感染致病的效應(yīng)蛋白已增加到20多種，其中EspF的作用范圍最廣，是多功能性的。腸致病型大腸埃希菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）的有關(guān)研究表明，EspF可與線粒體、核仁及細胞內(nèi)眾多蛋白分子結(jié)合，導(dǎo)致上皮細胞緊密連接破壞、微絨毛消失、細胞骨架重排、墊狀結(jié)構(gòu)( pedestal)形成，最終導(dǎo)致細胞凋亡。學(xué)術(shù)界認

6、為，分泌蛋白EspF對于研究A/E病原體致病作用的分子機制舉足輕重，甚至將其稱為細菌性病原體致病的“瑞士軍刀”。
　　 雖然，不同實驗室對EPEC中EspF蛋白在細胞特異性A/E損傷中的作用進行了深入研究，但是EHEC中EspF蛋白誘導(dǎo)宿主細胞凋亡的機制仍然不甚清楚，破壞腸上皮細胞緊密連接導(dǎo)致腸屏障功能喪失的動力學(xué)機制也不清楚。那么EHECO157∶H7中，EspF蛋白是否具有破壞細胞屏障功能，誘導(dǎo)細胞凋亡呢？EHECO157∶

7、H7侵襲黏附宿主上皮細胞后是否影響腸上皮細胞緊密連接，導(dǎo)致腸粘膜改變或脫落而導(dǎo)致細胞黏附-抹去損傷？EspF蛋白哪個功能域在起作用呢？
　　 本實驗的前期研究中，我們選取espF基因N端48-204bp序列作為敲除對象，采用重疊延伸PCR(OL-PCR)和同源重組技術(shù)，成功構(gòu)建了espF基因N端缺失突變株EHEC O157∶H7(△espF)。細菌黏附實驗和細胞毒性實驗表明，espF基因的缺失減弱了細菌對細胞的黏附能力和細胞毒性

8、作用，但不影響細菌的生物學(xué)特性。本研究擬在已構(gòu)建的△esp突變株的基礎(chǔ)上，利用EHEC O157∶H7野生型菌株和△espF突變株分別感染結(jié)腸癌Lovo細胞和BALB/c小鼠，采用免疫印跡法檢測感染細胞的Caspase家族凋亡蛋白酶-9/-3活性，采用TUNEL試驗法檢測體外感染細胞凋亡情況，比較EHEC野生型菌株和突變株感染后小鼠死亡率、結(jié)腸形態(tài)、結(jié)腸重量和結(jié)腸黏附細菌數(shù)量，熒光顯微鏡觀察結(jié)腸粘膜改變和細菌黏附情況。從蛋白分子、細胞水

9、平和動物感染模型著手，揭示EspF蛋白在EHECO157∶H7導(dǎo)致腸上皮細胞黏附-抹去損傷過程中的細胞凋亡作用。
　　 此外，本研究還采用PCR鑒定技術(shù)、細菌黏附性實驗和細胞LDH釋放實驗，對本實驗室收集的18株EHEC O157∶H7流行菌株進行毒力鑒定，為后續(xù)EHEC致病機制研究篩選毒力菌株提供理論依據(jù)。
　　 二、研究方法
　　 1.EHEC O157∶H7 EspF蛋白導(dǎo)致細胞凋亡的研究
　　 (

10、1) Lovo細胞中Caspase-9/3凋亡蛋白檢測根據(jù)Western Blot實驗步驟，用EHEC O157∶H7野生型菌株(WT)、espF基因缺失突變菌株(△espF)和放線菌素D(Act-D)分別處理Lovo細胞3h，激活Caspase家族蛋白酶-9/-3的活性。細胞裂解后提取蛋白，SDS-PAGE分離目的蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，用Caspase-9抗體和Caspase-3抗體孵育過夜，HRP標記的二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，

11、凝膠成像儀檢測細胞凋亡蛋白分泌情況。同時設(shè)置空白對照組，選擇微管蛋白Tubulin作為內(nèi)參對照，調(diào)節(jié)各組樣本量。
　　 (2) TUNEL細胞凋亡檢測 EHEC O157∶H7 WT、△espF菌株和Act-D分別處理Lovo細胞3h，并設(shè)置空白對照組。PBS漂洗，樣品經(jīng)固定、封閉、通透后，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒染色，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)。
　　 (3) EHEC

12、感染小鼠導(dǎo)致結(jié)腸A/E損傷的研究EHEC O157∶H7 WT、△espF和LB培養(yǎng)基分別灌胃接種BALB/c小鼠。第一批實驗小鼠感染后飼養(yǎng)20天，觀察小鼠生長和存活情況。另一批實驗小鼠于感染第七天處死，觀察結(jié)腸形態(tài)、水腫等病理特征，稱量結(jié)腸重量，涂板計數(shù)結(jié)腸黏附細菌數(shù)量。結(jié)腸經(jīng)4％多聚甲醛固定、30％蔗糖溶液脫水后制作冰凍切片，切片經(jīng)固定、通透后，用抗EHECO157∶H7抗體和羅丹明-鬼筆環(huán)肽進行染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)腸粘膜損傷和

13、細菌黏附情況。
　　 2.EHEC O157∶H7流行菌株的毒力鑒定
　　 根據(jù)E-hlyA，stx2, stx1基因序列設(shè)計引物，PCR檢測不同地區(qū)發(fā)生EHECO157∶H7暴發(fā)流行菌株的毒力基因;不同菌株感染Vero細胞3h，Giemsa染色觀察細菌對Vero細胞的黏附性;GENMED乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒檢測不同細菌作用細胞后釋放的LDH，通過計算LDH釋放率

14、，比較不同菌株的細胞毒性作用強弱。
　　 3.統(tǒng)計分析方法
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS13.0軟件，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TUNEL陽性細胞計數(shù)和結(jié)腸重量采用單向方差分析(One-WayANOVA)，各組均數(shù)的多重比較(Multiple Comparisons)采用LSD法（Least-significant Difference，最小顯著差值法）;結(jié)腸黏附細菌計數(shù)采用獨立樣本t檢

15、驗(Independent-Samples T test); LDH釋放率采用獨立樣本非參數(shù)檢驗。
　　 三、結(jié)果
　　 1.espF突變株導(dǎo)致細胞凋亡的能力比野生株低
　　 Lovo細胞感染后，EHEC野生株誘導(dǎo)組(WT)可見Caspase-9和Caspase-3清晰蛋白條帶，說明Lovo細胞產(chǎn)生了Caspase-9/3凋亡蛋白，而espF基因缺陷突變株誘導(dǎo)組(△espF) Caspase-9/3蛋白條帶顏色比

16、WT組淺，說明△espF感染細胞的凋亡蛋白表達水平低于WT組，但仍高于對照組。其次，各組的Caspase-3蛋白條帶顏色深于Caspase-9，說明感染細胞可能進入了凋亡后期。凋亡誘導(dǎo)劑放線菌素D(Act-D)處理組蛋白條帶顏色與WT組相仿，空白對照組也可見十分微弱的蛋白條帶。
　　 TUNEL法檢測Lovo細胞凋亡情況，WT和Act-D感染細胞發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光，TUNEL陽性細胞數(shù)較多，說明細胞發(fā)生了較嚴重的凋亡;△espF組

17、細胞綠色熒光較少，TUNEL陽性細胞數(shù)也少于WT組，表明其細胞凋亡程度輕于WT組?？瞻讓φ战M細胞未發(fā)現(xiàn)綠色熒光，說明未感染細胞無或極少發(fā)生凋亡。
　　 2.espF變株導(dǎo)致小鼠結(jié)腸A/E損傷程度比較野生株有所減輕
　　 野生株組、突變株組和對照組小鼠經(jīng)相應(yīng)細菌感染后，WT組小鼠病死率為30％，較△espF組高，小鼠腸道發(fā)生水腫，固化糞便較少，是細菌引起的出血性結(jié)腸炎的典型表現(xiàn);△espF組小鼠腸道較健康，帶有固化糞便，小

18、鼠無死亡。WT組感染小鼠結(jié)腸重量和黏附細菌數(shù)均高于△espF組小鼠。用小鼠抗EHECO157∶H7抗體和羅丹明鬼筆環(huán)肽，對結(jié)腸冰凍切片進行免疫熒光染色觀察，WT組結(jié)腸腸腔變大，粘膜微絨毛損傷或脫落，部分腸隱窩消失，粘膜上皮細胞表面和隱窩內(nèi)可見大量綠色熒光;△espF組結(jié)腸粘膜損傷不明顯，腸隱窩結(jié)構(gòu)較完整，細胞表面綠色熒光較少。說明WT組感染小鼠腸道粘膜損傷程度和黏附細菌數(shù)均高于△espF組感染小鼠。
　　 3.EHEC O157

19、∶H7流行菌株的毒力不完全相同
　　 PCR鑒定結(jié)果顯示，18株細菌中14株含溶血素E-hlyA基因，14株含stx2基因，只有8株含stx1基因。細胞黏附試驗和細胞毒性試驗發(fā)現(xiàn)，所有EHEC菌株黏附能力和細胞毒性均強于對照組，而且stx2基因表達蛋白的毒力強于stx1基因表達蛋白的毒力。其中中國流行菌株882364、01H112和日本流行菌株Cua9的Vero細胞毒性與國際菌株933W/O的細胞毒性接近，明顯高于其他菌株。

20、r>　　 四、結(jié)論
　　 1.espF基因N端序列缺失，使細菌的黏附性、細胞毒性和誘導(dǎo)細胞凋亡能力降低，導(dǎo)致腸上皮細胞破壞和A/E損傷程度減輕。表明EspF蛋白是細菌感染引起細胞凋亡的重要毒力因子之一，在腸上皮細胞的細菌定植和啟動細胞凋亡程序中至關(guān)重要。證實N端為EspF蛋白的功能區(qū)。
　　 2.EHEC不同菌株的毒力基因、細菌黏附力和Vero細胞毒性強弱不同，菌株882364、01H112、933W/O、Cua9毒力