瘤胃甲烷減排中草藥篩選及目標(biāo)中草藥的作用機制研究.pdf

1、減少反芻動物甲烷的排放對緩解溫室效應(yīng)和提高飼料利用率具有雙重意義。中草藥含有豐富的活性物質(zhì)，是一種潛在的瘤胃甲烷抑制劑，可通過調(diào)控瘤胃微生物菌群提高飼料利用率并抑制甲烷產(chǎn)生。本研究首先利用體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗技術(shù)對百味中草藥進行了篩選和驗證;然后討論了對抑制甲烷最有效的中草藥，紫蘇子（Perilla Frutescens Seed，PFS）的劑型和劑量效應(yīng)，并通過實時定量PCR、16S rDNA測序，探究了體外添加紫蘇子提取物(Peri

2、lla Frutescens Seed Extracts，PFSE)對瘤胃微生物數(shù)量和種群的影響;最后以潮羊為模式動物，研究了在日糧中添加PFSE對湖羊消化功能、甲烷生成和瘤胃發(fā)酵的影響。
　　1抑制甲烷生成的中草藥篩選和驗證
　　1.1初步篩選
　　利用體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗技術(shù)，發(fā)酵體系為10ml，底物為0.1g精粗比是30∶70(DM)的玉米和羊草混合物。單因素試驗設(shè)計，設(shè)置處理組100個，同時分別設(shè)置一個對照組和

3、一個空白組，每個處理有3個重復(fù)。其中100個處理組分別為百味中草藥的70％乙醇提取物，添加劑量為底物的4％(DM)，以40mg/ml的二甲基亞砜(DMSO)溶液的形式添加。對照組添加0.1ml DMSO，空白組無底物且不添加中草藥提取物及DMSO，以扣除人工瘤胃液的自身產(chǎn)氣量。體外發(fā)酵24h后測定產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，有31味中草藥降低甲烷產(chǎn)量達10％以上，其中降低甲烷產(chǎn)量最多的十味中草藥依次是山竹皮(74.9％)、厚樸(60.1

4、％)、乳香(45.4％)、蘇木(44.8％)、五加皮(42.6％)、姜黃(42.6％)、蛇床子(38.8％)、遠志(33.3％)、紫蘇子(30.1％)和辛夷(29.0％)。
　　1.2發(fā)酵驗證
　　對初篩中的31味中草藥的降甲烷效果進行驗證。同樣利用體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗技術(shù)，發(fā)酵體系擴大為50ml，底物為0.5 g的玉米和羊草混合物，精粗比為30∶70(DM)。采用單因素實驗設(shè)計，設(shè)置31個處理組，添加劑量仍然為底物的4％(

5、DM)，對照組添加0.5ml DMSO，空白組和標(biāo)準(zhǔn)羊草組同篩選試驗，每個處理有4個重復(fù)。體外發(fā)酵24 h后測定產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和其他瘤胃參數(shù)。在31味中草藥提取物中，有10味產(chǎn)氣量顯著減少（P＜0.05），6味產(chǎn)氣量顯著增加（P＜0.05）;12味顯著降低甲烷的產(chǎn)量（P＜0.05），只有桃仁提取物顯著增加了甲烷的產(chǎn)量(P＜0.05)。除遠志提取物之外，篩選試驗中降低甲烷產(chǎn)量最多的10味中草藥提取物在驗證試驗中被證實能夠顯著抑制甲烷生成

6、（P＜0.05）。12味中草藥提取物中，只有厚樸和酸棗仁在顯著抑制甲烷生成的同時又沒有減少產(chǎn)氣量（P＞0.05）。在31味中草藥提取物中，只有一味中草藥提取物（辛夷）顯著降低TVFA的濃度（P＜0.05），9味顯著降低乙丙比（P＜0.05），其中有7味來自12味顯著降低甲烷產(chǎn)量的中草藥提取物。紫蘇子在驗證試驗中降低甲烷產(chǎn)量的效果最好(63.6％)，因此作為目標(biāo)提取物做進一步研究。
　　2紫蘇子對瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響及機制

7、>　　不同劑型紫蘇子，即提取物、普通粉（80目）和超微粉（600目），主要成分均為長鏈脂肪酸，其中PFSE中十八碳不飽和脂肪酸含量最高(675μg/mg)，約是普通粉（295μg/mg）的2倍，超微粉(118μg/mg)的3倍。體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗結(jié)果表明，與高劑量PFSE（2％，0.2mg/ml，DM）、普通粉和超微粉相比，添加低劑量的PFSE(1％，0.1mg/ml，DM)顯著降低甲烷產(chǎn)量（P＜0.05）并顯著增加有效產(chǎn)氣量（P＜0

8、.05），對其他發(fā)酵參數(shù)沒有顯著影響（P＞0.05）。
　　同樣利用體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗技術(shù)，添加不同劑量PFSE，分別為底物干物質(zhì)的0、1％、2％、3％和4％，體外發(fā)酵24h。結(jié)果表明，產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量、TVFA、乙丙比以及干物質(zhì)消化率均隨PFSE劑量增加而線性降低，其中甲烷在添加量為1％時已下降顯著(P＜0.05)，而產(chǎn)氣量和TVFA分別是在2％和3％時下降顯著（P＜0.05）。實時定量PCR結(jié)果表明PFSE劑量不影響總細菌和

9、總甲烷菌數(shù)量，但降低原蟲數(shù)量（P＜0.05）。PFSE的添加對羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶和木聚糖酶的酶活性沒有顯著影響。
　　利用MiSeq高通量測序平臺對對照組(0％，0mg/mL)、低劑量組(2％，0.2mg/mL)和高劑量組(4％，0.4mg/mL)樣品微生物中細菌和古菌的16S rRNA基因進行擴增測序分析。(1) PFSE對細菌菌群的影響:不同處理組樣品的細菌Chao1豐富度指數(shù)沒有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），Sh

10、annon多樣性指數(shù)隨PFSE添加量的增加顯著降低。厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門占細菌總序列數(shù)的89.6％以上。其中，變形菌門相對豐度隨PFSE濃度的增加而線性增加(P＜0.05)，而擬桿菌門、纖維桿菌門、軟壁菌門則線性降低（P＜0.05）。細菌OTUs數(shù)隨PFSE劑量增加而降低。UniFrac分析表明添加0.4 mg/mL PFSE改變細菌群落，但0.2mg/mL添加濃度無影響。(2) PFSE對古菌菌群的影響:古菌Shannon指數(shù)

11、隨劑量增加而線性降低，但Chao1豐富度指數(shù)沒有發(fā)生顯著性變化。雖然qPCR結(jié)果顯示古菌總數(shù)不受PFSE添加的影響，但測序數(shù)據(jù)顯示Methanobrevibacter和Methanosphaera的相對豐度隨PFSE劑量增加而增加，而Methanobacteriaceae的相對豐度隨之降低。
　　微生物與甲烷產(chǎn)量、瘤胃發(fā)酵參數(shù)存在相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)系數(shù)將瘤胃微生物分為5組。組Ⅰ與甲烷產(chǎn)量和總VFA呈正相關(guān)（P＜0.05，r＞0.60

12、7），包括Fibrobacter、Sphaerochaeta和其他八種未分類的細菌與未分類的Methano bacteriaceae。Clostridium、Pedobacter、Anaeroplasma、Paludibacter、Ruminococcus、Zymomonas、Luteimonas和其他七種未分類的細菌被劃分為第2組，該組微生物與甲烷產(chǎn)量正相關(guān)，但與總VFA無關(guān)。與組Ⅰ相反，組Ⅲ中微生物與甲烷產(chǎn)量和總VFA都呈負相關(guān)（P

13、＜0.05，r＞-0.598），包括Roseomonas、Selenomonas、Shuttleworthia、Pseudobutyrivibrio、Anaerovibrio、Ruminobacter、Succinivibrio、Methanosphaera和三種未分類的細菌。組Ⅳ微生物與甲烷產(chǎn)量呈負相關(guān)（P＜0.05，r＞-0.650），包括Methanobrevibacter和未分類的Sinobacteraceae。組Ⅴ由兩種未分類

14、的菌組成，其與甲烷產(chǎn)量和總VFA都無關(guān)。
　　3紫蘇子提取物對湖羊甲烷生成影響的在體評定
　　采用反轉(zhuǎn)實驗設(shè)計，選取8只體況相近健康無病的成年公湖羊，設(shè)置對照組為基礎(chǔ)日糧（300g精料和700g羊草），處理組為基礎(chǔ)日糧上添加1％(DM)的PFSE。在湖羊日糧中添加1％(DM) PFSE，對湖羊的體重、干物質(zhì)采食量、干物質(zhì)消化率、粗蛋白消化率、中性洗滌纖維消化率和酸性洗滌纖維消化率均沒有顯著影響（P＞0.05），其中干物質(zhì)消化

15、率有降低的趨勢(P=0.086);以干物質(zhì)采食量為單位，與對照組相比處理組有降低瘤胃甲烷生成的趨勢（P=0.075），而以可消化干物質(zhì)和可消化纖維為單位，對照組和處理組瘤胃甲烷的生成量沒有顯著差異（P＞0.1）;添加PFSE對潮羊瘤胃的pH、NH3-N、乙酸、丙酸、丁酸、乙丙比和TVFA均沒有顯著影響（P＞0.1）。
　　綜上所述，中草藥具有良好的抑制瘤胃甲烷生成的效果，可作為潛在的甲烷抑制劑做進一步開發(fā);低劑量的PFSE能抑制甲