禽偏肺病毒F蛋白介導(dǎo)膜融合及抑制β-干擾素機(jī)制研究.pdf

1、禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)屬于副黏病毒科肺病毒亞科肺病毒屬。aMPV感染火雞引起火雞鼻氣管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT)，感染雞引起腫頭綜合征(Swollen head syndrome,SHS)，aMPV感染對養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重威脅。aMPV入侵宿主細(xì)胞需要病毒囊膜和細(xì)胞膜融合，這一過程是由融合蛋白(Fusion,F)介導(dǎo)的。然而，aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合的機(jī)

2、制尚不清楚。另外，aMPV感染造成繼發(fā)感染病毒或細(xì)菌，但這種免疫抑制效應(yīng)尚不清楚。本研究旨在闡述aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合機(jī)制和aMPV免疫機(jī)理。
　　aMPV和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)都屬于肺病毒屬。對于hMPV，胰酶和低pH誘導(dǎo)F蛋白介導(dǎo)膜融合呈現(xiàn)毒株依賴性。本研究中發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞型的aMPV(aMPV/A,aMPV/B和aMPV/C) F蛋白介導(dǎo)細(xì)胞融合不需要胰酶。添加胰酶可以促進(jìn)aMP

3、V/C F蛋白融合活性。通過突變F蛋白100或101位點(diǎn)的氨基酸，發(fā)現(xiàn)胰酶調(diào)節(jié)aMPVF蛋白的融合活性是由100和101位點(diǎn)決定。另外，低pH環(huán)境不能促進(jìn)aMPV/A和aMPV/B F蛋白融合活性，但能促進(jìn)aMPV/CF蛋白融合活性。突變F蛋白294位點(diǎn)的氨基酸，發(fā)現(xiàn)低pH調(diào)節(jié)aMPVF蛋白的融合活性是由殘基294G決定的。剖析aMPVF蛋白介導(dǎo)細(xì)胞融合所需基本條件有助于理解aMPV入侵機(jī)制。
　　aMPVF蛋白裂解不依賴外源性的

4、胰酶，意味著內(nèi)源性的蛋白酶就可以裂解aMPVF蛋白，但是宿主中的裂解酶尚未確定。我們發(fā)現(xiàn)跨膜絲氨酸蛋白酶(Transmembrane serine protease12, TMPRSS12)有助于裂解aMPV/B F蛋白。過表達(dá)TMPRSS12提高aMPV/BF蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B復(fù)制。干擾TMPRSS12降低aMPV/BF蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B復(fù)制。另外，我們發(fā)現(xiàn)aMPV/B F蛋白的100和101位

5、點(diǎn)被TMPRSS12識別，并證實(shí)HDS(組氨酸，天冬氨酸，絲氨酸)三聯(lián)體是TMPRSS12催化核心。重要的是我們發(fā)現(xiàn)TMPRSS12的mRNA在aMPV的靶器官存在。以上結(jié)果說明TMPRSS12有助于裂解aMPV/BF蛋白，為aMPV的預(yù)防與治療提供技術(shù)支持。
　　裂解的aMPVF蛋白介導(dǎo)膜融合的前提是與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，但是aMPVF蛋白受體尚不清楚。已知的aMPV/BF蛋白含有保守的RDD基序。我們假設(shè)RDD與細(xì)胞表面的整合

6、素結(jié)合啟動(dòng)F蛋白介導(dǎo)膜融合。為驗(yàn)證我們的假設(shè)，首先我們證實(shí)封閉整合素的多肽降低了aMPV/BF蛋白融合活性和病毒復(fù)制。同時(shí)我們通過抗體阻斷，干擾試驗(yàn)和過表達(dá)確定是aMPV/BF蛋白融合活性和病毒復(fù)制所需的是整合素αv和β1。其次，過表達(dá)整合素αv和β1使得aMPV/BF蛋白和aMPV能在非允許細(xì)胞系分別吸附和感染。最后突變RDD成RAE，aMPV/BF蛋白吸附能力和融合活性顯著下降。以上結(jié)果說明整合素αvβ1是aMPV/BF蛋白受體，促

7、使aMPV/BF蛋白介導(dǎo)膜融合和aMPV/B感染。
　　臨床觀察aMPV感染引起免疫抑制，但是免疫機(jī)理尚未闡明。I型干擾素(Type I interferons,IFN-I)像β-干擾素(Interferon-β,IFN-β)是機(jī)體防御的重要組分，在抵抗病毒和細(xì)菌感染中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)aMPV/B感染的雞和DF-1細(xì)胞后，IFN-β的表達(dá)降低。我們進(jìn)一步證實(shí)是aMPV/BF蛋白抑制IFN-β的產(chǎn)生。突變aMPV/BF蛋白的

8、100，101，93位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)aMPV/BF蛋白裂解水平?jīng)Q定aMPV/BF蛋白抑制IFN-β程度。干擾試驗(yàn)和多肽阻斷證實(shí)aMPV/BF蛋白下調(diào)IFN-β通過Toll樣受體3(Toll-likereceptors3,TLR3)和Toll樣受體4(Toll-likereceptors4,TLR4) 途徑，干擾試驗(yàn)和流式分析證實(shí)aMPV/BF蛋白下調(diào)IFN-β與簇分化抗原14(Cluster of differentiation14,

9、CD14)有關(guān)。重要的是aMPV/B F蛋白降低脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的免疫效應(yīng)。以上結(jié)果說明aMPV/B引起雞的免疫抑制好像是通過F蛋白與CD14結(jié)合從而降低IFN-β的產(chǎn)生。
　　aMPVF蛋白介導(dǎo)膜融合需要經(jīng)過裂解和結(jié)合受體的過程，剖析這些過程有助于了解aMPV的入侵和感染。上述研究證實(shí)，aMPVF蛋白的100，101和294位點(diǎn)決定胰酶和低pH調(diào)節(jié)F蛋白融合活性。我們進(jìn)一步揭示aMPV/B