維藥神香草活性部位的抗炎、平喘作用機(jī)理研究.pdf

1、目的：確定維藥神香草活性部位提取工藝，觀察其抗炎、平喘作用及其對哮喘大鼠炎癥細(xì)胞、因子的影響，探討其抗哮喘作用機(jī)理及其物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：1）通過小鼠抗炎、止咳、祛痰實(shí)驗(yàn)，觀察神香草水、醇提物及乙酸乙酯萃取部位抗炎、止咳、祛痰作用；2）采用OVA致敏和反復(fù)霧化法制備哮喘大鼠模型；通過HE染色觀察肺組織病理改變；計(jì)數(shù)各組大鼠BALF中的白細(xì)胞分類及 EOS個數(shù)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測

2、大鼠血清及BALF中ET-1水平、采用放射免疫法檢測哮喘大鼠血清中的ET-1、IL-2、介IL-6、TNF-ɑ水平；3）以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用比色法建立神香草總黃酮的含量測定方法；采用L9（34）正交試驗(yàn)，確定神香草總黃酮最佳提取工藝；采用L9（34）正交試驗(yàn)，確定 AB-8樹脂對神香草總黃酮的最佳分離純化工藝；以小鼠抗炎、止咳、祛痰實(shí)驗(yàn)，觀察神香草總黃酮抗炎、止咳、祛痰作用；在大鼠哮喘模型的基礎(chǔ)上，通過HE染色觀察肺組織病理改變；計(jì)數(shù)各

3、組大鼠BALF中的白細(xì)胞分類及EOS個數(shù)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測大鼠肺組織及BALF中TGF-β1水平；4）分別采用水蒸氣蒸餾法及超臨界 CO2萃取法提取神香草揮發(fā)油并對其進(jìn)行 GC-MS分析；采用L9（34）正交試驗(yàn)，確定神香草揮發(fā)油的超臨界最佳萃取工藝；以小鼠抗炎、止咳、祛痰實(shí)驗(yàn)，觀察神香草水揮發(fā)油抗炎、止咳、祛痰作用；在大鼠哮喘模型的基礎(chǔ)上，通過HE染色觀察肺組織病理改變；計(jì)數(shù)各組大鼠BALF中的白細(xì)胞分類及EO

4、S個數(shù)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測大鼠肺組織及BALF中TGF-β1平。
　　結(jié)果：1）與模型組比較，神香草水、醇提物及乙酸乙酯萃取部位具有抗炎、止咳、祛痰作用（P＜0.05），其中乙酸乙酯萃取部位作用更顯著；2）與模型組相比，神香草乙酸乙酯部位劑量組大鼠 BALF中細(xì)胞總數(shù)、Ly、Eos、Neu的百分比、ET-1水平及血清中的ET-1、IL-2、IL-6、TNF-ɑ水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；

5、各劑量組之間相互比較，BALF及血清中的以上指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），呈劑量依賴性趨勢。高、中劑量組能夠改善肺組織炎癥情況；3）通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在400-800nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長（507nm），采用比色法，以以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為: Y=12.06x-0.003，R2=0.9999線性關(guān)系良好；方法學(xué)考察表明，含量測定方法穩(wěn)定（RSD為0.71％）、準(zhǔn)確性較高（RSD=1.63%

6、）；按照含量測定方法測定神香草藥材總黃酮含量為2.68%，神香草乙酸乙酯部位總黃酮含量達(dá)到46.5%；以總黃酮的含量為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件為8倍量的70%的乙醇提取3次，每次1h；采用L9（34）正交試驗(yàn)，以總黃酮的含量為指標(biāo)，確定AB-8樹脂對神香草總黃酮的最佳分離純化工藝為樣品液濃度15mg/mL、乙醇濃度為70%、流速10mL/min時，分離純化的總黃酮含量達(dá)到66.7%；與模型組比較，神香草總黃酮具有

7、顯著的抗炎、止咳、祛痰作用（P＜0.05）；與模型組相比，神香草總黃酮各劑量組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、Ly、Eos、Neu百分比、TGF-β1水平及肺組織TGF-β1水平均明顯下降（P<0.05）；各劑量組能夠改善肺組織炎癥情況；4）采用水蒸氣蒸餾法提取神香草揮發(fā)油，含量達(dá)到0.68%。GC-MS分析，鑒定出65種化合物，檢出物為總量的100%（以面積歸一化法計(jì)算），其中含量較高的是亞油酸（13.83%）、棕櫚酸（13.80%）、（+）

8、-胡薄荷酮（8.31%）、（+）斯巴醇（6.27%）、二十一烷（5.34%）、香茅酸（4.07%）；采用L9（34）正交試驗(yàn)，確定神香草揮發(fā)油超臨界萃取最佳條件為20Pa壓力，35℃，流量2L/min，萃取1.5h，攜帶劑量為75%（無水乙醇：藥材比例=75ml:100g），含量達(dá)到5.5%。GC-MS分析，鑒定出34種化合物，其中γ-谷甾醇（31.882%）、二十一烷（19.953%）、亞麻酸（16.279%）、三十六烷（15.939

9、%）、棕櫚酸（13.80%）、亞麻酸乙酯（8.766%）等化合物含量較高；與模型組比較，神香草揮發(fā)油具有顯著的抗炎、止咳、祛痰作用（P＜0.05）；與模型組相比，神香草揮發(fā)油各劑量組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、Ly、Eos、Neu百分比、TGF-β1水平及肺組織TGF-β1水平均明顯下降（P<0.05）；各劑量組能夠改善肺組織炎癥情況。
　　結(jié)論：神香草水、醇、乙酸乙酯萃取物及總黃酮、揮發(fā)油均具有顯著的抗炎、止咳、祛痰、平喘作用。神香