三七單體皂苷對細胞縫隙連接的影響與其增強順鉑的細胞毒性作用的關系研究.pdf

1、目的：觀察三七單體皂苷（Rg1、Rb1、R1、Re）對穩(wěn)定表達連接蛋白32和連接蛋白26（connexin32/connexin26, Cx32/26）的Hela細胞縫隙連接(gap junction, GJ)功能的作用及其對順鉑細胞毒性的影響；同時進一步探討三七單體皂苷能否通過改變GJ功能增強順鉑的細胞毒性作用。
　　方法：1.轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx32/26的Hela細胞的培養(yǎng)、篩選及誘導：本實驗選用使用雙向質(zhì)粒（能夠表達異質(zhì)性

2、Cx32/26(PBI-Cx32T/Cx26)的載體質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染的HeLa細胞。這種雙向質(zhì)?？梢栽谝粋€啟動子的控制下同時表達Cx32和Cx26。一般情況下，Cx不表達；需要表達時，先用含 G-418、潮霉素的培養(yǎng)基篩選細胞，然后在培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素（Doxycycline，Dx）誘導 Cx表達。這樣能夠避免因過度表達Cx引起的細胞傷害。2.“細胞接種熒光示蹤法”觀察三七單體皂苷對培養(yǎng)細胞GJ功能的影響：將表達有Cx32/26的HeLa細

3、胞與熒光劑Calcine-AM共同孵育，制成“供體細胞（“Donor cell”）,在“Donor cell”中加入不同濃度的藥物。顯微鏡下挑選生長融合的細胞作為接受細胞，將上述含有不同藥物的“Donor cell”接種到接受細胞上，培養(yǎng)4小時,待形成穩(wěn)定的GJ后,熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)一個“供體細胞”周圍含有Calcine的“接受細胞”數(shù)作為評價GJ功能的指標。3.“標準細胞集落形成分析法”觀察三七皂苷對順鉑細胞毒性的影響：用不同密度

4、接種細胞的方法分別獲得有GJ形成（已融合）的細胞和無GJ形成（未融合）的細胞。在上述細胞，觀察三七皂苷單體預處理4h后，順鉑作用1h，對培養(yǎng)細胞的集落數(shù)的影響是否是通過GJ產(chǎn)生的。以細胞集落形成率的降低作為順鉑的細胞毒性指標。4.蛋白免疫印跡技術（Western blot）檢測三七單體皂苷對細胞中Cx32/26的表達水平的影響：收集細胞，提取細胞總蛋白；BCA法蛋白定量，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性；15％聚丙烯酰氨凝膠電泳；電轉(zhuǎn)

5、移至PVDF膜上；Western封閉液封閉2h；一抗孵育過夜；洗膜后二抗辣根酶標記山羊抗兔 IgG（1:5000）孵育1h；洗膜后于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)曝光，Quantity One分析軟件對實驗結(jié)果進行分析。
　　結(jié)果：1.“標準細胞集落形成分析法”結(jié)果顯示在有GJ形成的細胞，GJ抑制劑2-APB（2.3μg/ml）可顯著升高順鉑組的細胞集落形成率（P<0.05）；GJ增強劑RA（3μg/ml）可顯著降低順鉑組的細胞集落形

6、成率（P<0.05）。結(jié)果表明增強GJ功能可增強順鉑的細胞毒性，降低GJ功能可減弱順鉑的細胞毒性。2.“細胞接種熒光示蹤法”結(jié)果顯示，與陰性對照組相比較，Rb1(5μM-100μM)和 Re(5μM-100μM)作用4h對細胞GJ功能均無明顯影響（P>0.05）；5μM、10μM Rg1對GJ功能的影響與陰性對照組比較無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05），25μM、50μM、100μM Rg1作用細胞4h后，供體細胞周圍含有Calcine-

7、AM的接受細胞數(shù)目明顯增多，且呈一定的劑量依賴性，其中100μM Rg1對GJ功能的增強作用最為明顯，其增強率為44.04%±8.71%；100μM Rg1作用不同時間（4h、24h、48h）對GJ功能的影響無明顯差異（P>0.05）；R1（10μM-100μM）能濃度依賴性的增強由Cx32/26組成的HeLa細胞的GJ功能，50μM R1繼續(xù)作用24h、48h對GJ功能的影響與4h相比較無明顯差異。3.Western blot結(jié)果顯示

8、，與陰性對照組比較，不同濃度的Rg1（25μM-100μM）和R1（25μM-100μM）作用4h對HeLa細胞Cx32/26的表達水平均無顯著性差異（P>0.05）。4.在有GJ形成的細胞，100μM Rg1預處理細胞4h后，加入順鉑作用1h，Rg1與順鉑聯(lián)合使用組的細胞集落形成率(0.29±0.12)顯著低于單用順鉑組(0.48±0.07)，表明在有GJ形成時Rg1能增強順鉑的細胞毒性，而在無GJ形成的細胞，Rg1對順鉑的細胞集落形

9、成率無明顯影響；在有GJ形成的細胞和無 GJ形成的細胞，R1（50μM）與順鉑合用組的細胞集落形成率與順鉑組相比較均無明顯差異（P>0.05），結(jié)果表明R1對順鉑的細胞毒性無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.有GJ形成時，下調(diào)細胞GJ功能能顯著降低順鉑的細胞毒性；上調(diào)細胞GJ功能能顯著增強順鉑的細胞毒性。
　　2.Rb1、Re對Cx32/26組成的GJ功能無明顯影響，Rg1、R1能顯著增強Cx32/26組成的GJ功能。<