毛鉤藤葉的生藥學(xué)鑒定及藥理學(xué)研究.pdf

1、研究背景：
　　 鉤藤具有清熱平肝、息風(fēng)定驚之功效,是中醫(yī)臨床治療肝風(fēng)內(nèi)動(dòng),驚癇抽搐的常用中藥。2005年版《中國(guó)藥典》規(guī)定中藥鉤藤為茜草科植物鉤藤Uncariarhyuchophylla(Miq.)Jacks.、華鉤藤 U.siueus(Oliv.)Havil.、大葉鉤藤U.macrophylla Wall、毛鉤藤 U.hirsute Havil.,無(wú)柄果鉤藤 U.sessillfructus Roxb.的干燥帶鉤莖枝。

2、>　　 作為中藥鉤藤,傳統(tǒng)的藥用部位是帶鉤莖枝。但最近的研究發(fā)現(xiàn)鉤藤葉的總生物堿含量與帶鉤莖枝相近,且葉中化學(xué)成分與鉤相似。而鉤藤葉的資源產(chǎn)量卻遠(yuǎn)比鉤藤帶鉤莖枝的產(chǎn)量高,可見(jiàn)鉤藤葉作為一種藥用資源,來(lái)源豐富,藥用價(jià)值及綜合利用潛力都很大。但由于缺乏對(duì)鉤藤葉進(jìn)行系統(tǒng)的藥學(xué)和藥理毒理學(xué)研究,使其一直沒(méi)有被開(kāi)發(fā)利用,大量的鉤藤藥用資源一直處于廢棄狀態(tài)。
　　 研究目的
　　 目前對(duì)毛鉤藤藤莖、鉤的顯微鑒別研究已有報(bào)道,尚未見(jiàn)

3、有關(guān)其葉的塵藥學(xué)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)毛鉤藤葉的藥材性狀、顯微結(jié)構(gòu)、理化鑒別等進(jìn)行研究,以期為該藥材的鑒定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。
　　 毛鉤藤葉含有鉤藤堿和異鉤藤堿,有效成分與鉤藤的帶鉤莖枝相似,因此對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用理應(yīng)與傳統(tǒng)鉤藤相似。目前對(duì)鉤藤的研究多集中于該植物帶鉤的莖枝,而對(duì)于該植物的其他部位研究報(bào)道較少,為證明毛鉤藤葉與傳統(tǒng)鉤藤具有相似的藥理作用,本課題將對(duì)毛鉤藤葉的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用進(jìn)行初步的藥理學(xué)

4、研究,為開(kāi)發(fā)和利用鉤藤葉資源提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 由于毛鉤藤葉含有與傳統(tǒng)鉤藤入藥部位(帶鉤莖枝)相同和不相同的化學(xué)成分,導(dǎo)致了兩者藥理作用上的相同性和不一致性。鑒于毛鉤藤葉所含化學(xué)成分的特殊性,本課題在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,對(duì)毛鉤藤葉治療抑郁癥模型動(dòng)物進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)研究,以闡明毛鉤藤葉對(duì)抑郁癥的干預(yù)或調(diào)節(jié)作用,為該藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.生藥學(xué)鑒定方法:石蠟切片:新鮮毛鉤藤葉

5、片,經(jīng)FAA固定液固定,常規(guī)石蠟切片,番紅.固綠染色制成永久片。表面撕片:撕取毛鉤藤葉上下表皮,制成臨時(shí)水裝片。毛鉤藤葉的生物堿沉淀反應(yīng)參考中國(guó)藥典2005版鉤藤的鑒定方法進(jìn)行。毛鉤藤葉的薄層層析色譜法:取鉤藤對(duì)照藥材及毛鉤滕葉樣本粉末各1g,加濃氨水使?jié)駶?rùn),加三氯甲烷30ml,以40kHZ超聲波提取,濾液用2％H2SO4溶液萃取三次,合并萃取液后調(diào)節(jié)Ph值,堿化后溶液用三氯甲烷萃取三次,合并三氯甲烷萃取液后回收溶劑至干,殘?jiān)眉状既芙?/p>

6、。取樣本點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇為展開(kāi)劑,在層析缸中飽和后上行展開(kāi)10cm,取出,晾干,顯色。
　　 2.小鼠自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 昆明種小鼠50只,雌雄各半,禁食12h,飲水不限。將小鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(同容量生理鹽水組),鉤藤(即毛鉤藤帶鉤莖枝,下同)組(12g/kg)和毛鉤藤葉低(6g/kg)、中(9g/kg)、高(12g/kg)三劑量組。每組10只動(dòng)物。將各組小鼠放入YLS-1A多功能小動(dòng)物自主

7、活動(dòng)記錄儀中,適應(yīng)5 min后,測(cè)定小鼠給藥前的自主活動(dòng)次數(shù),記錄時(shí)間為5 min。記錄時(shí)室內(nèi)保持安靜。然后按劑量給各組小鼠灌胃給藥(ig)。分別于給藥后30 min、60 min各測(cè)定1次自發(fā)活動(dòng)數(shù),記錄5min內(nèi)各組小鼠的活動(dòng)數(shù)。
　　 3.戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量誘導(dǎo)小鼠入睡實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠50只,雌雄各半。將小鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(同容量生理鹽水組),鉤藤組(12g/kg)和毛鉤藤葉低(6g/kg)、中(9g/k

8、g)、高(12g/kg)三劑量組。按各組劑量給小鼠ig給藥,藥后60 min后給每只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg,以小鼠翻正反射消失1min以上為入睡標(biāo)準(zhǔn),記錄15 min內(nèi)各組小鼠的入睡個(gè)數(shù)。
　　 4.戊巴比妥鈉閾劑量誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)分為5組。將小鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(同容量生理鹽水組),鉤藤組(12g/kg)和毛鉤藤葉低(6g/kg)、中(9g/kg)、高(12g/

9、kg)三劑量組。按各組劑量給小鼠ig給藥,藥后60 min后給每只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/l(g,然后記錄各組小鼠的睡眠時(shí)間(以給藥后小鼠翻正反射消失為入睡時(shí)間,翻正反射消失至恢復(fù)為睡眠時(shí)間)。
　　 5.硫酸士的寧致小鼠驚厥實(shí)驗(yàn) 取SPF級(jí)昆明種小鼠60只,雌雄各半,禁食12 h,飲水不限。將小鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(同容量生理鹽水組),陽(yáng)性藥對(duì)照組(地西泮,1.5 mg/kg),鉤藤(即毛鉤藤帶鉤莖枝,下同)

10、組(12 g/kg),毛鉤藤葉低(6 g/kg)、高(12g/kg)劑量組。每組12只動(dòng)物。分別灌胃(ig)給藥。給藥后30 min,腹腔注射(ip)硫酸士的寧(1.5 mg/kg),記錄驚厥小鼠數(shù),驚厥反應(yīng)以小鼠出現(xiàn)四肢陣攣或強(qiáng)直性驚厥為指標(biāo)。
　　 6.小鼠懸尾“失望”抑郁模型實(shí)驗(yàn):取昆明種小鼠60只,雌雄各半。將小鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(同容量生理鹽水組),陽(yáng)性藥對(duì)照組(鹽酸阿米替林,30 mg/kg),鉤藤組(12

11、 g/kg),毛鉤藤葉低(6 g/kg)、高(12 g/kg)劑量組。每組12只動(dòng)物。分別灌胃(ig)給藥。連續(xù)給藥5天,于術(shù)次給藥后24 h,用膠布將小鼠尾端2 cm的部位貼在一水平木棍上,使動(dòng)物成倒掛狀態(tài),其頭部離臺(tái)面約5 cm,懸掛兩側(cè)用板隔開(kāi)動(dòng)物視野。記錄小鼠在6 min內(nèi)靜止不動(dòng)的時(shí)間。采用Smart-16動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 7.大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)致獲得性絕望抑郁模型實(shí)驗(yàn):取SPF級(jí)SD大鼠50只,雌雄各

12、半。將大鼠隨機(jī)分為5組,即空白對(duì)照組(同容量生理鹽水組),陽(yáng)性藥對(duì)照組(鹽酸阿米替林,15 mg/kg),鉤藤組(12 g/kg),毛鉤藤葉低(6 g/kg)、高(12 g/kg)劑量組。每組10只動(dòng)物。分別灌胃(ig)給藥。連續(xù)給藥5天,于末次給藥后2 h,將大鼠放入水深18-22 cm的量筒內(nèi)(40 cm高,18cm寬直徑),水溫25℃,預(yù)試15 min后將動(dòng)物取出,在32℃下烤干身體。24 h后,將動(dòng)物重新放入上述環(huán)境中,記錄大鼠

13、在水中5 min內(nèi)保持漂浮不動(dòng)的時(shí)間(注:不動(dòng)是指動(dòng)物在水中停止掙扎,或呈漂浮狀態(tài),僅露出鼻孔保持呼吸,可有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面)。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析,組間多重比較方差齊時(shí)用L,SD方法,不齊時(shí)用Dunnett's T3方法。小鼠給藥前后自發(fā)活動(dòng)次數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,方差不齊是采用近似方差分析Welch法。P<

14、0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料采用貯檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果
　　 1.對(duì)毛鉤藤葉進(jìn)行生藥學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),毛鉤藤葉含眾多多細(xì)胞非腺毛,柵欄組織細(xì)胞2列,葉片薄璧細(xì)胞含草酸鈣簇晶,于上表面的表皮下層細(xì)胞沿網(wǎng)脈成列分布,氣孔直軸式,薄層層析顯示與對(duì)照藥材至少有2種相同的生物堿成分。
　　 2.中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,鉤藤組(12g/kg)與毛鉤藤葉低(6g/kg)、中(9g/kg)、高(12g/kg)三個(gè)劑量

15、組均能使小鼠自發(fā)活動(dòng)減少,使戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量致小鼠入睡個(gè)數(shù)增多,延長(zhǎng)戊巴比妥鈉閾劑量睡眠時(shí)間及驚厥的潛伏時(shí)間,且以毛鉤藤葉高劑量組效果最為明顯。
　　 3.采用小鼠懸尾“失望”抑郁模型實(shí)驗(yàn)及大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),觀察毛鉤藤葉的抗抑郁作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,高劑量毛鉤藤葉(12g/kg)可以明顯縮短抑郁癥模型動(dòng)物的懸尾不動(dòng)時(shí)間及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間,且藥效與陽(yáng)性對(duì)照藥無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論
　　 (1)毛鉤藤葉的

16、性狀鑒別和微特征均具有形態(tài)學(xué)規(guī)律,可作為對(duì)其進(jìn)行生藥鑒學(xué)定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 (2)生物堿沉淀反應(yīng)和薄層層析色譜分析結(jié)果表明,毛鉤藤葉與鉤藤對(duì)照藥材具有相同的化學(xué)成分,尤其在生物堿方面至少有兩種相同的成分。
　　 (3)毛鉤藤葉提取物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的抑制作用,表現(xiàn)為減少小鼠自主活動(dòng)時(shí)間,增加戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量致小鼠入睡個(gè)數(shù),延長(zhǎng)戊巴比妥鈉閾劑劑量致小鼠睡眠時(shí)間,同時(shí)表現(xiàn)出明顯的抗士的寧致小鼠驚厥作用。毛鉤藤葉