精子發(fā)生過(guò)程中NXF3和crossover interference的功能研究.pdf

1、不育癥是影響人類健康的一種常見(jiàn)重大疾病，其發(fā)病率很高，然而大部分的非梗阻性無(wú)精癥(non-obstructiveazoospermia，NOA）患者病因不明，臨床治療時(shí)無(wú)從下手。多年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)NOA患者發(fā)病原因可能與睪丸中血-睪屏障（Blood-testisbarrier，BTB）的缺陷和減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體同源重組異常有關(guān)，但對(duì)這兩個(gè)事件發(fā)生異常的分子調(diào)控機(jī)理仍然不太清楚。
　　 曲精小管中由相鄰支持細(xì)胞構(gòu)成的血-睪屏障(

2、BTB)會(huì)在生精上皮周期中的第Ⅷ期、第Ⅸ期經(jīng)歷一個(gè)破壞、重建的過(guò)程來(lái)幫助前細(xì)線期或細(xì)線期的精母細(xì)胞完成由basalcompartments向adluminalcompartments的遷移。此過(guò)程的異常會(huì)導(dǎo)致前細(xì)線期或細(xì)線期的精母細(xì)胞不能進(jìn)入adluminalcompartments完成減數(shù)分裂或者是引起抗自身精細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，從而引起不育。鑒于BTB破壞、重建的過(guò)程受到細(xì)胞因子TGF-β3的調(diào)控，本文的第一個(gè)研究課題是尋找影響TGF-

3、β3表達(dá)、分泌的因素及其分子機(jī)制。
　　 本文研究發(fā)現(xiàn)核輸出因子蛋白家族(NXF)成員之一的NXF3特異性表達(dá)在睪丸組織中的支持細(xì)胞細(xì)胞之中，并且它起始表達(dá)的時(shí)間和小鼠青春期BTB開(kāi)始建立時(shí)間一致；除睪丸中的支持細(xì)胞外，NXF3還特異性表達(dá)在附睪頭部Ⅱ區(qū)的主細(xì)胞中，起始表達(dá)的時(shí)間和第一次生精波完成后睪丸液進(jìn)入附睪的時(shí)間一致，并且它在附睪中的表達(dá)是睪丸液依賴。探尋NXF3和TGF-β3在不同情況下的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是生理?xiàng)l件還

4、是病理?xiàng)l件，如熱刺激、CdC12處理，二者的表達(dá)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在支持細(xì)胞中，TGF-β信號(hào)通路可以對(duì)細(xì)胞因子TGF-β3的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，并且這種轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控是NXF3部分依賴的。具體來(lái)講是，TGF-β信號(hào)通路可以通過(guò)激活Smad2/3途徑來(lái)抑制TGF-β3的表達(dá)，NXF3的可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Smad2/3途徑的徑活性從而進(jìn)一步抑制細(xì)胞內(nèi)TGF-β3的表達(dá)。接著我們對(duì)NXF3影響TGF-β信號(hào)通路的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)

5、NXF3可以與TGF-β信號(hào)通路的抑制因子STRAP結(jié)合，二者的相互作用可以通過(guò)破壞STRAP與Smad7的結(jié)合來(lái)影響TβRI(TD)-STRAP-Smad7復(fù)合體的形成，從而增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)TGF-β-Smad信號(hào)通路活性。除參與調(diào)節(jié)TGF-β3的表達(dá)、分泌外，我們發(fā)現(xiàn)NXF3還可以通過(guò)影響TGF-β-Smad信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)支持細(xì)胞中其它重要基因的表達(dá)，如與BTB相關(guān)的基因Claudin11、WT1以及與支持細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)的基因GAT

6、A1、p21.
　　 減數(shù)分裂過(guò)程中同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂前期Ⅰ，是在同源配對(duì)的非姐妹染色單體之間進(jìn)行的，它的發(fā)生可以確保減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的正確分離。同源重組是個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，涉及DSBs形成、單鏈DNA末端入侵、中間體Holliday交叉形成等一系列過(guò)程,最后在同源配對(duì)染色體間的形成交換位點(diǎn)(Crossovers，COs，由粗線期聯(lián)會(huì)復(fù)合體上的MLH1蛋白標(biāo)記)。COs形成過(guò)程中受到正干涉的調(diào)控，即一個(gè)COs的形成排斥其

7、它COs在其附近形成，本文的第二個(gè)課題中對(duì)人類染色體上COs間的干涉特征及其影響因素進(jìn)行研究。
　　 首先，通過(guò)綜合運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和多色熒光原位雜交技術(shù)（cenM-FISH）對(duì)每條粗線期聯(lián)會(huì)復(fù)合體(synaptonemalcomplexs，SCs)及SCs上的COs進(jìn)行了標(biāo)記，測(cè)量出相鄰Cos之間的距離并擬合到gammamodel中計(jì)算出用于定量交換干涉強(qiáng)度的參數(shù)υ，而后對(duì)其進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)干涉強(qiáng)度在染色體內(nèi)、染色體間和個(gè)體間

8、均存在異質(zhì)性，具體來(lái)講就是:染色體上臂間干涉強(qiáng)度大于臂內(nèi)干涉強(qiáng)度，這可能是由著絲粒引起的；小號(hào)染色體的干涉強(qiáng)度大于大號(hào)染色體上的干涉強(qiáng)度；個(gè)體之間的每條染色體上的干涉強(qiáng)度也存在變異，但沒(méi)發(fā)現(xiàn)規(guī)律。進(jìn)一步分析顯示，SCs的結(jié)構(gòu)異常會(huì)影響Cos間的干涉強(qiáng)度，比如9號(hào)染色體上易出現(xiàn)的不連續(xù)區(qū)域(gaps)和未聯(lián)會(huì)區(qū)域(splits)兩種結(jié)構(gòu)異常會(huì)cis/trans影響本身和其它染色體上干涉強(qiáng)度。另外，我們的研究也表明Cos間的干涉可通過(guò)著絲粒