黃粉蟲體內(nèi)脂類抗菌活性物質(zhì)及凝集素的研究.pdf

1、試驗(yàn)分別用五種不同有機(jī)溶劑：丙酮、石油醚、無水乙醇、苯、乙酸乙酯對黃粉蟲幼蟲和成蟲勻漿物進(jìn)行浸泡提取，選用大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subilis)、普通變形桿菌(Proteas valgaris)、黃曲霉(Aspergillus lfavas)、黑曲霉(Aspergillus nige)作為指示菌，采用圓形紙片擴(kuò)散抑菌法檢

2、測上述各提取物對6種指示菌的抗菌活性，結(jié)果表明乙酸乙酯提取物的抗菌效果最好，對6種指示菌均表現(xiàn)了很強(qiáng)的抗菌作用，以后試驗(yàn)選用乙酸乙酯作為黃粉蟲體內(nèi)脂類抗菌活性物質(zhì)的提取劑。 選用乙酸乙酯對黃粉蟲幼蟲和成蟲勻漿物進(jìn)行浸泡提取，利用圓形紙片擴(kuò)散抑菌法，分別檢測幼蟲和成蟲脂類粗提物對11種常見細(xì)菌的抗菌活性，結(jié)果表明：黃粉蟲幼蟲和成蟲提取物粗品對11種細(xì)菌均有顯著抑菌效果，但對同一種菌來說，兩種粗提物的抑制效果不同，而且同一提取物對不

3、同菌的敏感性也不同。 黃粉蟲幼蟲和成蟲粗提取物經(jīng)硅膠(100-200目)柱層析后，分離出三種不同極性洗脫組份：無極性組份(石油醚洗脫組份)、弱極性組份(苯洗脫組份)、強(qiáng)極性組份(乙醇洗脫組份)?？咕钚詸z測結(jié)果顯示，幼蟲和成蟲的石油醚、苯洗脫組份對11種供試細(xì)菌均無抑菌作用；而兩種乙醇洗脫組份對11種供試菌都表現(xiàn)了很強(qiáng)的抑菌效果。 分別將黃粉蟲幼蟲和成蟲脂類粗提物、乙醇洗脫組份進(jìn)行最低抑菌濃度MIC(Minimun in

4、hibitory concentration)試驗(yàn)，結(jié)果表明：幼蟲和成蟲乙醇洗脫組份對各種菌的MIC值與粗提物相比，明顯降低。 利用以下兩種展層劑：幼蟲(石油醚：丙酮=3:2)、成蟲(石油醚:乙酸乙酯=3:1)對黃粉蟲幼蟲和成蟲乙醇洗脫組份進(jìn)行薄層層析，分別得到四個(gè)條帶。將收集的各條帶用乙醇溶解，進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示幼蟲乙醇洗脫組份薄層層析得到的四個(gè)條帶中，Rf0.62的抗菌活性最強(qiáng)；成蟲乙醇洗脫組分薄層層析得到的四個(gè)條帶中R

5、t0.625的抗菌活性較之其它條帶較強(qiáng)。分別將這兩條活性較強(qiáng)的條帶樣品經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析其化學(xué)成分，結(jié)果顯示幼蟲和成蟲抗菌活性較強(qiáng)條帶的化學(xué)成分有所不同：幼蟲活性較強(qiáng)條帶的化學(xué)成分主要是肉豆蔻酸，成蟲活性較強(qiáng)條帶的化學(xué)成分主要是(E)-9-十八碳烯酸。 采用生長速率法檢測幼蟲和成蟲粗提物對黃曲霉、玉米大斑病病菌(Helminthosporiu)、稻瘟病病菌(Piricularia oryzae)、黑曲霉的抑菌活

6、性，結(jié)果顯示兩種粗提物對四種受試真菌都具有很強(qiáng)的抑制效果，這一發(fā)現(xiàn)將為開發(fā)新的抗真菌藥物提供重要來源。 黃粉蟲幼蟲和成蟲三種不同極性組分對4種受試真菌菌絲生長的影響結(jié)果顯示幼蟲和成蟲三種不同極性洗脫組份對四種菌都表現(xiàn)了一定的抑制作用，但抑制效果不同，乙醇洗脫組分對各種菌的抑制效果最好。 黃粉蟲幼蟲和成蟲脂類薄層層析各條帶對4種真菌的相對抑制率結(jié)果顯示，各條帶對4種真菌都具有一定的抑制效應(yīng)，其中幼蟲的Rf0.475和成蟲的

7、Rf0.337對四種真菌菌絲生長速率的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于其它條帶，抑制率都在30％以上。 分別將這兩條抗真菌活性較強(qiáng)的條帶樣品經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法進(jìn)行化學(xué)成分分析，結(jié)果顯示當(dāng)保留時(shí)間為3.740min，幼蟲條帶Rf0.475樣品有一個(gè)較大的峰，它代表相對含量較高的甘油(76.56％)；當(dāng)保留時(shí)間為23.756 min時(shí)，成蟲條帶Rf0.337樣品有一個(gè)較大的峰，它代表相對含量較高的甘油單油酸酯(80％)。幼蟲和成蟲體內(nèi)

8、抗真菌物質(zhì)主要成分和含量的不同，可能正是造成抗真菌活性差異的主要原因。 黃粉蟲幼蟲、蛹、成蟲三種蟲態(tài)的凝集素對11種紅細(xì)胞的凝集效價(jià)結(jié)果顯示，幼蟲、蛹、成蟲三種蟲態(tài)的凝集素對不同紅細(xì)胞的凝集效應(yīng)不同，蛹凝集素的凝集效應(yīng)最弱，成蟲凝集素的凝集效應(yīng)最強(qiáng)。三種蟲態(tài)的凝集素對兔血紅細(xì)胞都表現(xiàn)了較高的凝集效應(yīng)，以后試驗(yàn)中均以2％家兔紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞。 分別對黃粉蟲幼蟲、蛹、成蟲三個(gè)蟲態(tài)的凝集素的理化性質(zhì)進(jìn)行測定：pH敏感性試驗(yàn)結(jié)

9、果顯示，三種蟲態(tài)的凝集素都具有很強(qiáng)的耐酸性；熱敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，三種蟲態(tài)的凝集素都對熱較敏感，80℃以上時(shí)三種蟲態(tài)的凝集素均失去凝集活性；5種不同濃度的金屬離子對黃粉蟲三種蟲態(tài)的凝集素凝集效應(yīng)的影響結(jié)果顯示，Zn2+、Cu2+能明顯提高三種凝集素的凝集活力，尤其是Cu2+的激活作用更強(qiáng)；L-鼠李糖與果糖溶液對3種蟲態(tài)的凝集素的凝集活性表現(xiàn)了較強(qiáng)的抑制作用。 采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose(Fast Flow)離子

10、交換層析、SephacrylS-200-HR凝膠過濾層析對黃粉蟲幼蟲凝集素進(jìn)行純化，SDS-PAGE顯示為明顯的單一條帶，亞基分子量約為76KDa；采用Sephacryl S-200-HR凝膠過濾層析法測得其表觀分子量為238KDa，說明黃粉蟲凝集素為多聚體，是由76KDa的亞基聚合成分子量為278KDa的蛋白。 用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為對照，測得黃粉蟲凝集素樣品中蛋白濃度為2.4 ug/ul。蒽酮-硫酸

11、法檢測黃粉蟲幼蟲凝集素樣品中中性糖含量為53.25ug/ml。 采用日立835氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸組分，除色氨酸水解被破壞未測出外，黃粉蟲幼蟲凝集素可測出17種氨基酸，其中含量最高的為谷氨酸，其次為天門冬氨酸和亮氨酸，分別占氨基酸總數(shù)的11.87％和9.256％，含量最少的為甲硫(蛋)氨酸和組氨酸，分別占氨基酸總數(shù)的1.61％和1.81％。 用UV2201型紫外分光光度計(jì)對黃粉蟲幼蟲凝集素溶液進(jìn)行240-320nm

12、的波長掃描，以蒸餾水為空白對照，取樣間隔為1nm，測得黃粉蟲幼蟲凝集素紫外吸收光譜的最大吸收峰在265nm。 本研究以黃粉蟲為材料，使用有機(jī)溶劑提取體內(nèi)的脂類物質(zhì)，進(jìn)行體外抗菌活性試驗(yàn)，研究抗菌物質(zhì)對常見的細(xì)菌和動(dòng)植物病原菌的抑制作用，并利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法進(jìn)行化學(xué)成分分析，以此來了解其抗菌作用機(jī)理，為尋找抗生素替代品尋找新的材料來源。其次通過對黃粉蟲幼蟲、蛹、成蟲三種蟲態(tài)的凝集素凝集紅細(xì)胞的特性及理化性質(zhì)的研究，