miR-X-miR-2861表達簇與轉(zhuǎn)錄因子Runx2調(diào)控環(huán)路在成骨細胞分化中的功能研究.pdf

1、第一部分一個新型小鼠成骨細胞表達miRNA的克隆及表達模式分析
　　 目的:探尋新的小鼠成骨細胞表達的微小核糖核酸(microRNA,miRNA),并研究其在小鼠不同組織和細胞中的表達模式。
　　 方法:提取小鼠成骨細胞小分子RNA,經(jīng)Poly(A)加尾、連接5'端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行PCR擴增,回收PCR產(chǎn)物后連接至pcDNA3.1 TOPO載體構(gòu)建cDNA文庫,進行菌落PCR,陽性克隆測序后選取19-26 n

2、t大小的RNA進行生物信息學分析確定新的miRNAs。通過Northern blot檢測新的miRNA在小鼠成骨細胞、破骨細胞、骨組織、肝臟、心臟、腎臟、肺、脾、大腦、脂肪及骨骼肌的表達,并進一步檢測其在BMP-2誘導的小鼠基質(zhì)細胞ST2成骨分化過程中的表達模式。
　　 結(jié)果:(1)共克隆得到162個小分子RNA序列,68個為miRNA分子,明確2個為新克隆的miRNA,其中一個命名為miR-X,其在小鼠與人類之間具有保守性,位

3、于小鼠第二染色體。(2)miR-X在小鼠成骨細胞、骨組織及肝臟中均有表達,其中成骨細胞中表達最高,其他組織及破骨細胞不表達。(3)在BMP-2誘導的ST2細胞成骨分化過程中,miR-X隨時間延長其表達量不斷增加。
　　 結(jié)論:通過構(gòu)建小鼠成骨細胞小分子RNA的cDNA文庫的方法,新克隆了一個在小鼠與人類存在保守性的新miRNA-miR-X。miR-X在小鼠成骨細胞、骨組織、肝臟中表達,其中成骨細胞中表達最高,并且在小鼠成骨細胞分

4、化過程中的表達呈時間依賴特性。
　　 第二部分 miR-X對成骨細胞分化的影響及預測和鑒定其靶基因的研究
　　 目的:研究miR-X在小鼠基質(zhì)細胞ST2成骨分化中的作用并預測及實驗驗證miR-X的靶基因。
　　 方法:根據(jù)miR-X前體序列設計引物,經(jīng)退火處理后與線性化的pSilencer4.1CMV puro載體連接,構(gòu)建miR-X表達載體pre-miR-X。將pre-miR-X或2'-O-methyl修飾的反

5、義寡核苷酸anti-miR-X分別轉(zhuǎn)染BMP-2誘導分化的ST2細胞(300ng/ml),造成miR-X在成骨分化過程中的過表達或功能抑制。轉(zhuǎn)染48小時后,采用分光光度計檢測對硝基苯酚釋放來反映堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,放射免疫測定法測定骨鈣素(osteocalcin,OC)分泌,采用Westernblot和實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt relatedtranscr

6、iption factor2,Runx2)蛋白和mRNA表達的變化。采用多種靶基因預測軟件預測miR-X的靶基因。PCR擴增含靶位點的靶基因編碼區(qū)(coding sequence,CDS),產(chǎn)物連接pGL3載體,構(gòu)建野生型Hoxa2CDS熒光素酶報告基因載體,采用定點突變技術(shù)構(gòu)建突變型Hoxa2CDS熒光素酶報告基因載體,分別與miR-X表達載體共轉(zhuǎn)染BMP-2誘導的ST2細胞,通過熒光素酶活性變化證實Hoxa2是否為miR-X靶基因。

7、將miR-X表達載體單獨轉(zhuǎn)染ST2細胞,采用Western blot和實時定量PCR檢測Hoxa2蛋白和mRNA水平的變化,驗證miR-X對Hoxa2的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:(1)miR-X過表達促進BMP-2誘導的ST2細胞成骨分化過程中的ALP活性增高和OC分泌,并增加Runx2 mRNA和蛋白的表達。(2)抑制miR-X的作用降低了ST2成骨分化過程中的ALP活性及OC分泌的上升程度,并部分抑制Runx2 mRNA和蛋白

8、的表達。(3)Rnas22預測Hoxa2為miR-X的靶基因。(4)與對照組相比,共轉(zhuǎn)染野生型Hoxa2 CDS熒光素酶報告基因載體及miR-X表達載體的ST2細胞熒光素酶活性顯著下降,而共轉(zhuǎn)染突變型Hoxa2 CDS熒光素酶報告基因載體及miR-X表達載體的ST2細胞熒光素酶活性無明顯變化。(5)轉(zhuǎn)染miR-X表達載體的ST2細胞Hoxa2蛋白水平下降,但Hoxa2 mRNA表達無明顯變化。
　　 結(jié)論:miR-X在轉(zhuǎn)錄后水平

9、抑制靶基因Hoxa2,增加轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達,從而促進BMP-2誘導的ST2細胞的成骨分化。
　　 第三部分miR-X和miR-2861與轉(zhuǎn)錄因子Runx2相互調(diào)控的功能研究
　　 目的:探索兩個新克隆的miRNA,miR-X和miR-2861之間的關(guān)系及其與轉(zhuǎn)錄因子Runx2的相互作用。
　　 方法:通過BLAST等生物信息學方法尋找miR-X與miR-2861在基因組上的定位,分析兩者之間的位置關(guān)系,采

10、用Mfold軟件預測初級轉(zhuǎn)錄本(primary microRNA,pri-miRNA)的二級結(jié)構(gòu)。通過國外公布的人類及小鼠轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)預測文庫,根據(jù)第四位賴氨酸三甲基化的H3組蛋白(H3K4me3)在TSS位點周圍的富集與啟動子CpG島為主要標識,預測miR-X/miR-2861表達簇的TSS。運用TF-seach轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測軟件分析miR-X/miR-2861表達簇的TSS上游2kb內(nèi)的DNA序列,預測可能的Runx

11、2結(jié)合位點。通過染色體免疫沉淀法(ChIP),采用Runx2抗體(anti-Runx2)驗證Runx2與所預測結(jié)合位點的相互關(guān)系。通過PCR擴增Ⅱ型Runx2 cDNA并亞克隆至pSG5載體,構(gòu)建Runx2表達載體pSG5-Runx2,轉(zhuǎn)染ST2細胞,并將體外合成的特異性阻斷Runx2蛋白表達的小干擾RNAsiRNA-Runx2,轉(zhuǎn)染BMP-2誘導的ST2細胞,分別采用Northern blot檢測miR-X和miR-2861的表達,研

12、究Runx2對miR-X與miR-2861表達的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:(1)miR-X與miR-2861在小鼠第2染色體上的基因定位僅相差69bp,兩者以miR-X/miR-2861表達簇的形式存在。(2)確定miR-X/miR-2861表達簇的轉(zhuǎn)錄起始位點位于小鼠第2染色體10,104,622。(3)預測Runx2在miR-X/miR-2861表達簇啟動子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點在其TSS上游2kb。(4)ChIP證實Runx2結(jié)合于

13、所預測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。(5)與對照組細胞相比,轉(zhuǎn)染Runx2表達載體的ST2細胞中,miR-X與miR-2861的表達增強。而轉(zhuǎn)染siRNA-Runx2的BMP-2誘導ST2細胞miR-X與miR-2861的表達降低。
　　 結(jié)論:miR-X與miR-2861在基因組中成簇存在,共同轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子Runx2通過與miR-X/miR-2861表達簇的啟動子結(jié)合,促進表達簇的轉(zhuǎn)錄,并與miR-X和miR-2861形成正反饋調(diào)控環(huán)