擬南芥不同生態(tài)型響應(yīng)鹽脅迫的自然變異研究.pdf

1、鹽脅迫是影響植物生長和農(nóng)作物產(chǎn)量的一個重要環(huán)境限制因素。鹽脅迫易引發(fā)離子脅迫和滲透脅迫，最終導致植物葉面積擴展受阻、光合作用以及生物量積累降低等。植物在適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境時形成了許多耐受調(diào)節(jié)機理，如Na+的外排、Na+區(qū)隔化進入液泡、可溶性物質(zhì)的積累和活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的清除等。深入認識植物耐鹽生理和分子機制，不僅具有重要的科學意義，而且還能為將來作物的耐鹽育種提供重要的理論指導。
　　擬

2、南芥作為科學研究的一種重要模式植物，其生態(tài)型分布在世界各地，形態(tài)多樣，因此，不同生態(tài)型的擬南芥是研究植物對各種環(huán)境脅迫響應(yīng)機制的良好材料。先前文獻報道，植物的耐鹽性是由多基因控制、多種生理生化及分子機制調(diào)控下的綜合表現(xiàn)性狀，但是，目前關(guān)于擬南芥不同生態(tài)型響應(yīng)鹽脅迫的自然變異及其調(diào)控機理仍不是很清楚，尚需進一步深入研究。
　　因此，我們以本實驗室保存的82種分布于不同地域的擬南芥生態(tài)型為實驗材料，分別對其進行鹽脅迫處理，共篩選出了7

3、種耐鹽生態(tài)型（以Col-0作參照），并對其應(yīng)答鹽脅迫的生理生化性狀進行了較全面的分析和比較，進一步探究了擬南芥響應(yīng)鹽脅迫的自然變異及其分子調(diào)控機制，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.擬南芥耐鹽生態(tài)型的篩選、鑒定和相關(guān)耐鹽生理指標的測定
　　82種不同擬南芥生態(tài)型分布在歐洲(Europe)、亞洲(Aisa)、東非(North Africa)和北美洲(North America)等，對此進行150 mM和200 mM NaCl處

4、理，以Col-0做參照，共篩選出了7種耐鹽生態(tài)型，分別是Bs-1(Switzerland)、Mog-11(France)、Looe-2(UK)、Got-1(Germany)、Wil-1(Russia)、Nd-1(Germany)和Sav-0(CzechRep)。為進一步確證其耐鹽性，又進行了一系列不同濃度梯度(0 mM、150 mM、180mM和200 mM NaCl)的鹽處理，結(jié)果表明，在上述不同的鹽處理條件下，它們均表現(xiàn)出較強的耐鹽

5、性狀，而且在高鹽液態(tài)MS培養(yǎng)基中的短期鹽脅迫或移栽入土后長期高鹽溶液的澆灌處理后，也均表現(xiàn)出較強的耐鹽性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與Col-0相比，各耐鹽型擬南芥在鹽脅迫下有較長的主根、較高的葉綠素含量以及較低的子葉白化率。另外，各耐鹽型擬南芥在鹽脅迫下積累較少的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，表明其細胞膜傷害程度輕，耐鹽能力強。
　　2.擬南芥不同耐鹽型在鹽脅迫下的Na+、K+離子平衡的調(diào)控
　　先前研究表明，細

6、胞內(nèi)高水平的K+和低的Na+/K+比率對植物的耐鹽性起到至關(guān)重要的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與Col-0相比，無論是鹽脅迫還是非鹽脅迫狀態(tài)下，各耐鹽生態(tài)型植株中的Na+含量均無明顯差異，表明Na+含量的變化并不是各耐鹽生態(tài)型耐高鹽脅迫的關(guān)鍵性因素。有意思的是，鹽處理后，所檢測生態(tài)型中K+含量均下降，但與Col-0相比，各耐鹽型仍保持較高的K+含量，進而表現(xiàn)出較低的Na+/K+比率，這表明擬南芥各耐鹽生態(tài)型中較高的K+含量對其耐鹽性起到重要的

7、調(diào)控作用。
　　進一步采用非損傷微測技術(shù)對Col-0和各耐鹽生態(tài)型中的K+流動情況進行測定，結(jié)果顯示，在非脅迫狀態(tài)下，所檢測的各生態(tài)型均呈現(xiàn)為向細胞外的K+凈流速，鹽脅迫狀態(tài)下亦如此，但與Col-0相比，各耐鹽型均有較低的K+凈流速，表明各耐鹽型體內(nèi)較高的K+含量是與其較低的K+凈流速相一致的，同時也表明各耐鹽型在鹽脅迫下具有較強的K+滯留或阻礙K+流失的能力。進一步對K+吸收的重要轉(zhuǎn)運載體基因AtHAK5、AtCHX17和AtK

8、UP1的表達水平進行qRT-PCR檢測，比較分析后發(fā)現(xiàn)，它們在各耐鹽型中的表達水平與其高的K+含量呈現(xiàn)正相關(guān)性。鹽處理后，AtHAK5在各耐鹽型中的表達水平均明顯高于Col-0，在Mog-11和Got-1中該基因的表達水平尤為顯著，比Col-0高出10倍以上。另外，AtCHX17和AtKUP1也在鹽脅迫后被顯著誘導表達，尤其在耐鹽型Mog-11、Looe-2和Wil-1等中該基因的誘導表達更為明顯。
　　SOS信號通路相關(guān)基因和N

9、HX及HKT蛋白家族編碼基因是植物耐鹽的重要調(diào)控因子，SOS信號通路中的AtSOSs和AtNHX1，分別調(diào)控Na+向外排出細胞和Na+進入液泡區(qū)隔化，而AtHKT1;1則參與了Na+由根向莖的運輸過程，它們均是Na+轉(zhuǎn)運相關(guān)的重要運輸載體。為了檢測這些轉(zhuǎn)運載體在不同生態(tài)型中參與耐鹽脅迫是否有差異，我們通過測序比較分析了各個耐鹽生態(tài)型中的AtSOS1序列變異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該蛋白重要的C末端自抑制結(jié)構(gòu)域中第1116位的氨基酸發(fā)生了突變(

10、T1116A)，但是，該位點的變異在鹽敏感型中也存在，由此可知，該位點的突變并不能影響SOS1蛋白的功能。同樣，耐鹽型中的AtSOS2、AtSOS3、AtNHX1和AtHKT1;1基因也無明顯的有效突變。進一步通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，各生態(tài)型中AtSOS基因的表達水平無明顯變化，表明各生態(tài)型在調(diào)控Na+外排的效率上沒有明顯差別，這與其體內(nèi)相似的Na+含量水平是相一致的。另外，在100 mM NaCl處理3h后，與Col-0

11、相比，耐鹽型Mog-11、Looe-2和Sav-0中AtNHX1的表達水平下降;鹽脅迫下，大多數(shù)耐鹽型中AtHKT1;1的表達水平也較Col-0低。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明SOS信號通路、AtNHX1和AtHKT1;1在擬南芥各生態(tài)型中相當保守，在應(yīng)答鹽脅迫的過程中發(fā)揮基礎(chǔ)性的調(diào)控作用，并不是造成各耐鹽型和Col-0之間的耐鹽性差異的關(guān)鍵調(diào)控因子。
　　3.擬南芥不同耐鹽型在鹽脅迫下的可溶性物質(zhì)的差異積累
　　植物合成的

12、可溶性物質(zhì)的積累對細胞特別是處于脅迫狀態(tài)下的細胞具有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫下各耐鹽型擬南芥中均有較高的可溶性物質(zhì)（包括脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖）的積累，特別是脯氨酸的積累水平尤為顯著，進一步研究發(fā)現(xiàn)，與Col-0相比，脯氨酸降解相關(guān)的基因AtProDH1和AtP5CDH在各耐鹽型中的表達水平明顯較低，這是與其較高的脯氨酸含量相一致的，而脯氨酸合成相關(guān)的基因AtP5CR、AtP5CS1和AtP5CS2沒有顯著變化。
　　4

13、.擬南芥不同耐鹽型在鹽脅迫下的差異性ROS應(yīng)答
　　ROS是介導鹽脅迫響應(yīng)的重要信號分子。為了闡明ROS信號在不同生態(tài)型參與耐鹽脅迫的作用機制，我們對各耐鹽的生態(tài)型進行了ROS水平檢測及相關(guān)基因表達分析。NBT和DAB染色檢測的結(jié)果表明，與Col-0相比，鹽處理后各耐鹽型確實具有較低的ROS水平。另外，我們也檢測了SOD的活性，結(jié)果顯示各耐鹽型中均有較高的SOD活性，進一步研究發(fā)現(xiàn)，編碼一種SOD的基因AtCSD1在各耐鹽型中具有