13個(gè)稻瘟菌基因的表達(dá)譜分析及受稻瘟病誘導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)錄因子OsBTB基因的生物學(xué)功能初探.pdf

1、在前期工作中，對(duì)受稻瘟菌生理小種103(PO6-6)侵染2、4、8 h的抗性水稻品系C101A51(攜帶Pi2)葉片mRNA構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行EST測(cè)序，共獲得了12,270條高質(zhì)量的ESTs并產(chǎn)生5,741條獨(dú)立基因。應(yīng)用BLASTn程序?qū)⑦@些序列分別與水稻和稻瘟菌基因組序列進(jìn)行搜索(E-value≤e-15)，結(jié)果有36 TUTs與稻瘟菌基因組匹配，其中有13條獨(dú)立基因僅與稻瘟菌基因組同源。利用本實(shí)驗(yàn)室保存的受稻瘟菌侵染的水稻葉

2、片cDNA文庫(kù)中2,171個(gè)獨(dú)立EST克隆制備完成的cDNA陣列，以稻瘟菌侵染8 h的水稻近等基因系H7R/H7S的葉片總RNA為探針，通過(guò)芯片雜交、信號(hào)提取以及數(shù)據(jù)分析后，得到一批功能未知的基因。對(duì)未知基因通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼含有BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白的基因(克隆號(hào)為J001E09)并命名為OsBTB。為了確證這13個(gè)推測(cè)的稻瘟菌基因的生物信息學(xué)結(jié)果和其在稻瘟菌致病性中可能的生物學(xué)功能；通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物并測(cè)序獲得了OsBTB基因

3、的全長(zhǎng)cDNA。 分別提取稻瘟菌生理小種Y34和粳稻秀水11基因組，運(yùn)用Southern blot雜交后，結(jié)果表明這13個(gè)基因確實(shí)來(lái)源于稻瘟菌，生物信息學(xué)分析表明，除2個(gè)未知基因外，有2個(gè)分別編碼環(huán)孢菌素(Cyclophilin)和P型ATP酶的基因(GenBank受理號(hào)BI808723和BQ907640)與稻瘟病菌侵染早期附著孢形成相關(guān)；C-4甲基固醇氧化酶和δ-固醇C-甲基轉(zhuǎn)移酶(BI813122和BQ907428)參與稻瘟

4、病菌致病性相關(guān)的膜蛋白——麥角固醇的合成；還有可能與稻瘟病菌侵染過(guò)程中信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的質(zhì)膜鈉離子應(yīng)答蛋白(3I812033)；與蛋白合成相關(guān)的核糖體L12蛋白(BM420098)和延伸因子2(BQ907452)；與真核細(xì)胞細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和分泌相關(guān)的外被體蛋白(BI813165)；參與脂肪酸生物合成的烯酰還原酶(BQ907177)等。一個(gè)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(BQ908235)參與了稻瘟菌孢子的產(chǎn)生；從受稻瘟病菌誘導(dǎo)水稻葉

5、組織中篩選到的這些基因可能在病原與寄主的相互作用中起重要作用。Northernblot結(jié)果表明，這些基因在稻瘟菌的附著胞階段都有不同程度的表達(dá)。除了環(huán)孢菌素基因在菌絲體階段有表達(dá)外，其它基因在該階段均未檢測(cè)到。其中，質(zhì)膜鈉離子反應(yīng)2基因(BI812033)和Nebula相關(guān)蛋白(BM419917)僅在幼附著胞階段表達(dá)；而參與麥角固醇的2個(gè)基因的表達(dá)模式相類似；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因在附著胞的發(fā)育過(guò)程中其表達(dá)呈遞減趨勢(shì)。這些結(jié)果不僅反

6、映了它們可能的生物學(xué)功能，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了它們是高豐度基因。 根據(jù)生物信息學(xué)獲得的OsBTB基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，從水稻cDNA文庫(kù)J001E09克隆中通過(guò)PCR擴(kuò)增到基因的全長(zhǎng)序列，測(cè)序確證了該基因的全長(zhǎng)為1,975bp的cDNA序列，其中包含一個(gè)1,677bp的開(kāi)放讀碼框。該基因編碼一個(gè)含558個(gè)氨基酸的蛋白，并含有一個(gè)保守的BTB結(jié)構(gòu)域。該序列與GenBank水稻基因組序列進(jìn)行比對(duì)，獲得長(zhǎng)度為5,144bp

7、的DNA序列，其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)在上游30 bp處，TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-27bp處，CAAT框位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約-110bp處。OsBTB基因全長(zhǎng)5,174bp，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。對(duì)OsBTB基因編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，該蛋白與核蛋白GMPOZ的同源性為73.34％。 利用珍汕97B/密陽(yáng)46重組自交系群體明確OsBTB基因在染色體中的位置，發(fā)現(xiàn)該基因以單拷貝形式在水稻第二號(hào)染色體公共標(biāo)記RZ324和

8、RM71之間，遺傳距離分別為0.4 cM和4.2 cM。 將OsBTB的編碼區(qū)ORF克隆進(jìn)原核表達(dá)載體，純化獲得重組的OsBTB融合蛋白。并以重組OsBTB蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔獲得其多克隆抗體，westernblot結(jié)果證明該多克隆抗體能夠與OsBTB蛋白結(jié)合，說(shuō)明該蛋白編碼正確。用western blot檢測(cè)不同水稻品系與不同稻瘟菌生理小種非親和/親和互作該蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，OsBTB蛋白在這些反應(yīng)中的表達(dá)譜呈現(xiàn)

9、多元化，不同水稻品種及其相應(yīng)的稻瘟菌生理小種之間非親和/親和互作基因表達(dá)不同。用膠體金免疫標(biāo)記法檢測(cè)受稻瘟菌的水稻H7R葉片細(xì)胞，初步結(jié)果表明，OsBTB蛋白在水稻細(xì)胞中無(wú)亞細(xì)胞特異性定位。用定量RT-PCR方法檢測(cè)了OsBTB基因以及9個(gè)功能已知的基因(如Pi-ta、Pib、葡萄糖苷酶基因、富含甘氨酸蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因和遍在蛋白基因)在近等基因系H7R/H7S中連續(xù)5個(gè)時(shí)間段的表達(dá)情況

10、，結(jié)果表明，OsBTB基因與Pi-ta、Pib、幾丁質(zhì)酶基因和富含甘氨酸的蛋白基因在表達(dá)趨勢(shì)上基本上一致，即從0 h到12 h，這些基因的表達(dá)在抗性品系中都呈上升趨勢(shì)；而在感病品系中，在8 h達(dá)到高峰，12 h有所下降，在24 h達(dá)到最高峰。但OsBTB基因在抗性品系中在24h中達(dá)到最高峰，而其它4個(gè)基因表達(dá)有所下降。這些基因在抗性反應(yīng)中的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間明顯早于感病反應(yīng)。從檢測(cè)的其它幾個(gè)參與PR反應(yīng)的已知功能基因如葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶