雄性中華鱉(Pelodiscus sinensis)生殖生物學(xué)特性研究.pdf

1、繁殖是動物生活史中最為重要的一個環(huán)節(jié)，能否正常、順利地進(jìn)行繁殖，關(guān)系到物種的延續(xù)及物種的多樣性。由于爬行動物處于動物進(jìn)化過程中的特殊地位，是脊椎動物最先登陸的類群，能否在陸上繁殖就成為進(jìn)一步發(fā)展的主要矛盾。因此，對此環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。然而，有關(guān)中華鱉生殖特性方面的研究鮮有報道。中華鱉(Pelodiscus sinensis)是龜鱉目鱉科的代表動物之一，是我國重要的特種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物，具有重要的營養(yǎng)價值和藥用價值。在生殖周期中，

2、由于中華鱉具有典型的冬眠現(xiàn)象和精子儲存的生理學(xué)特征，是研究爬行動物生殖生物學(xué)的理想模式動物。本文首先對中華鱉精子的超微結(jié)構(gòu)及其變態(tài)發(fā)生過程進(jìn)行了觀測，進(jìn)而探究了生精上皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的年周期變化以及在這個過程中細(xì)胞增殖和凋亡動態(tài)。在此基礎(chǔ)上探討了激素受體在相關(guān)生殖器官(由于雌性的輸卵管具有精子儲存功能，所以也在此一并研究)的分布規(guī)律。研究結(jié)果將從細(xì)胞和分子水平闡明雄性中華鱉生殖生物學(xué)特性，并為中華鱉的繁殖、保護(hù)及資源利用等應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)

3、。 試驗I：中華鱉精子的超微結(jié)構(gòu)研究應(yīng)用透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)觀察了中華鱉精子的超微結(jié)構(gòu)。成熟的精子由頭部、連接段、中段、主段和末段組成。頭部呈細(xì)長的錐體狀，細(xì)胞核前1/3為核前突，表面被頂體復(fù)合體覆蓋。頂體下錐直接包繞核前突，頂體帽與頂體下錐之間為頂體下間隙。3～5條縱行的核內(nèi)小管與頂體下錐頭端的桿狀物相延續(xù)。連接段位于核后窩內(nèi)，由縱行短的節(jié)柱組成。中段由中央的中心粒和周圍的線粒體鞘組成。線粒體鞘由7～8圈線粒體環(huán)形排列而成，

4、每圈約有5個線粒體，上、下層線粒體錯位1/2排列。線粒體形態(tài)為8-10層排列的同心圓狀，其平行的板層實為長而彎曲分布的線粒體嵴。這種線粒體嵴和細(xì)胞內(nèi)大量的糖元顆粒，與中華鱉成熟精子長時間貯存并保持活力有關(guān)。線粒體鞘末端的楔形終環(huán)明顯。近-遠(yuǎn)端中心粒相互垂直排列。近端中心粒的結(jié)構(gòu)模式是9×3+0，管壁三聯(lián)微管呈典型的風(fēng)車狀。遠(yuǎn)端中心粒的結(jié)構(gòu)模式為9×3+2，中央微管和外周三聯(lián)微管周圍均與致密纖維重合排列，前部的外周致密纖維相互融合成連續(xù)的

5、一圈，向后各致密纖維逐漸分離。主段具有發(fā)達(dá)的環(huán)行纖維鞘，前厚(數(shù)層)后薄(一層)。中央的軸絲復(fù)合體呈9×2+2，在與第3和第8號二聯(lián)微管相對的部位可見兩條與纖維鞘融合的縱行纖維。橫切面上，主段二聯(lián)微管A管上的動力臂明顯，兩條中央微管間有短的橫橋連接，中央微管通過放射狀輻與二聯(lián)微管A管相連。末段僅由軸絲復(fù)合體和表面的細(xì)胞膜組成，其中的微管逐漸分散成單個排列。中華鱉精子的結(jié)構(gòu)在一些細(xì)節(jié)和數(shù)量上與龜鱉目的海龜和烏龜存在一定差異，更與其它綱動物

6、和龜鱉目之外的其它爬行動物差異明顯。 試驗II：中華鱉精子的形成應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察了中華鱉精子的形成過程。精子的形成過程包括細(xì)胞核的拉長、染色質(zhì)的濃縮、頂體和鞭毛的形成、細(xì)胞質(zhì)的排除。第I期，前頇體泡形成并移向細(xì)胞核一側(cè)，同側(cè)核膜凹陷成淺窩。前頂體泡底部中央出現(xiàn)小的頇體顆粒，纖維物質(zhì)層位于核前端與前頂體泡底壁之間，其核膜一側(cè)的中央形成更小的頂體下顆粒，將與核內(nèi)小管的形成有關(guān)。細(xì)胞核開始端移和變形。第II期，前項體泡變成扁囊狀覆

7、蓋于隆突的核頂端，頂體顆粒彌散成中等電子致密物分布于頂體帽中，纖維物質(zhì)層發(fā)育為頂體下錐。環(huán)形核套微管在頂體后端的核周圍逐漸形成，核內(nèi)染色質(zhì)開始濃縮成圓形顆粒，伴隨著細(xì)胞核的偏移，細(xì)胞質(zhì)開始發(fā)生重排。第III期，拉長的細(xì)胞核前端凸出，表面有頂體復(fù)合體覆蓋，變態(tài)的精子頭部扎在支持細(xì)胞的凹陷中，核后端最寬并出現(xiàn)植入窩，染色質(zhì)進(jìn)一步濃縮。線粒體向后拖移位于細(xì)胞核的后端，許多微管開始組裝成鞭毛的軸絲復(fù)合體。第IV期，染色質(zhì)濃縮成致密均質(zhì)物，環(huán)形核

8、套微管先后改建為斜行和縱行核套微管，支持細(xì)胞突起形成“袖領(lǐng)”包繞頂體。多余的細(xì)胞質(zhì)后拖，形成與頭部和中段相連的胞質(zhì)葉，它逐漸的脫落排除。第V期，精子的頭部開始成熟，核套微管解聚而消失，頂體周圍的“袖領(lǐng)”也消失。線粒體開始排列在近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒周圍，在線粒體的后端，纖維鞘環(huán)繞在鞭毛軸絲復(fù)合體的周圍。 試驗III：中華鱉睪丸和附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)的年周期變化應(yīng)用組織學(xué)方法，對性成熟雄性中華鱉睪丸、附睪在年周期中的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了較系

9、統(tǒng)的觀察和分析，以揭示其生殖的年周期變化規(guī)律。結(jié)果表明：中華鱉睪丸的年周期活動由7個特征明顯的時期構(gòu)成。4月份為第I期，為精原細(xì)胞的增殖期；5～6月份是精原細(xì)胞復(fù)蘇、增殖、分化形成精母細(xì)胞時期，為第II期；7～8月份為第III期，是精母細(xì)胞分裂成為精細(xì)胞時期；9～10月份是精子形成期，大量的精子細(xì)胞變態(tài)成為成熟的精子，此期為IV期；11月份為第V期，生精上皮主要由精原細(xì)胞和大量的精子組成，精母細(xì)胞基本上已消耗完；12月至次年1月份為第V

10、I期，精子發(fā)生漸趨停滯，只有殘留的少量精子。2月份為第VII期，精子發(fā)生已經(jīng)停滯。睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)的季節(jié)性變化反應(yīng)了雄性中華鱉的生殖年周期規(guī)律，而且與組織學(xué)觀察結(jié)果相一致。中華鱉精子產(chǎn)生限定在一年內(nèi)的特定階段，雄性產(chǎn)生精子與雌性的排卵及受精間是異相的。因此，中華鱉的生精類型屬于分離型模式，而且精子發(fā)生的模式是時間性的發(fā)育模式，明顯與鳥類和哺乳類不同。 試驗IV：中華鱉繁殖周期中生精細(xì)胞的增殖和凋亡應(yīng)用電鏡技術(shù)、增殖細(xì)胞核抗原(

11、PCNA)以及脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)，研究了繁殖期和非繁殖期生精上皮細(xì)胞的增殖和凋亡情況。PCNA免疫組織化學(xué)反應(yīng)顯示：在7月、9月(繁殖期)精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞的細(xì)胞核都呈陽性反應(yīng)；12月、1月(非繁殖期)大部分的精原細(xì)胞和少量的初級精母細(xì)胞呈陽性，但繁殖期初級精母細(xì)胞的陽性率比非繁殖期的高很多。TUNEL法標(biāo)記的大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)在12月、1月份的曲細(xì)精管中，其中大量的初級精母細(xì)胞和少量的精子細(xì)胞發(fā)

12、生凋亡，并且這種陽性細(xì)胞在整個生精停滯期(非繁殖期)都存在，但生精期幾乎未見任何的凋亡細(xì)胞。初級精母細(xì)胞是主要的凋亡細(xì)胞類型。電鏡下所見的凋亡細(xì)胞同樣發(fā)生在非繁殖期，核染色質(zhì)固縮邊聚，呈半月形、環(huán)形、球形或不規(guī)則形高電子密度的濃縮核，有的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體。而繁殖期各級生精上皮細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，核呈均質(zhì)狀，胞質(zhì)無濃縮現(xiàn)象。制作超薄切片時保留半薄切片，甲苯胺蘭染色，光鏡觀察在非繁殖期也看到凋亡現(xiàn)象?；谝陨系慕Y(jié)果，我們認(rèn)為初級精母細(xì)胞和精

13、子細(xì)胞的凋亡是非繁殖期生精上皮損失的主要原因，并且正常的季節(jié)改變對中華鱉生精上皮細(xì)胞具有時間和空間特殊性。 試驗V：雄激素受體和雌激素受體α在中華鱉生殖器官中的分布首次用雄激素受體(Androgen receptor，AR)和雌激素受體α(Estrogen receptorα，ERα)的多克隆抗體在中華鱉睪丸、附睪和輸卵管中進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位研究。結(jié)果表明，特異性AR免疫陽性反應(yīng)見于睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、肌樣細(xì)胞、支持細(xì)胞、精原細(xì)胞

14、、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。雄激素受體在中華鱉生精細(xì)胞中的階段性表達(dá)表明，它與相應(yīng)的激素結(jié)合后，調(diào)節(jié)精子發(fā)生，可能與精原細(xì)胞的增殖、精母細(xì)胞的成熟分裂及精子形成密切相關(guān)。雌激素受體α主要表達(dá)于睪丸的間質(zhì)細(xì)胞，生精細(xì)胞只在生精活躍期呈弱陽性反應(yīng)，表明雌激素主要通過體細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，而它在生精細(xì)胞中階段性分布表明它也可以直接調(diào)節(jié)生精細(xì)胞。由于雌性中華鱉的輸卵管具有精子儲存功能，在此與雄性生殖器官一并進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這兩種類固醇激素受體在中華鱉輸卵

15、管內(nèi)均有陽性分布，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞腔面、腺細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，表明它們可能均與精子的儲存及輸卵管的腺體分泌有關(guān)。 試驗VI：中華鱉睪丸雄激素受體mRNA的表達(dá)采用原位雜交技術(shù)(In situhybridization，ISH)研究雄激素受體mRNA在中華鱉睪丸的存在及細(xì)胞定位。取10只健康成年中華鱉的睪丸，進(jìn)行冰凍切片。用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針對組織切片進(jìn)行原位雜交，檢測雄激素受體mRNA在睪丸組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。結(jié)果顯示：大