20512.腸桿菌(enterobactersp.cn1)甲酸代謝及相關產氫基因的研究

1、分類號分類號碩士學位論文腸桿菌（Enterobactersp.CN1）甲酸代謝及相關產氫基因的研究StudyonfmicacidmetabolismrelatedgenesofhydrogenproductioninEnterobactersp.CN1姓名邱玉鋒學號10908050所在學院理學院導師姓名胡忠專業(yè)生物化學與分子生物學入學日期2009年9月答辯日期2012年6月汕頭大學碩士學位論文：腸桿菌（Enterobactersp.CN

2、1）甲酸代謝及相關產氫基因的研究I摘要氫氣由于其高效、清潔、無污染而被認為是未來最具潛力的能源；生物制氫與其他制氫方法相比，只需在常溫常壓下進行且底物利用范圍廣，故具有良好的發(fā)展前景。然而，目前已有菌種及其發(fā)酵工藝條件優(yōu)化后的產氫量仍未能到達工業(yè)化生產的要求，所以應用分子生物學的手段對菌種及其代謝途徑的改造就顯得非常有必要。發(fā)酵產氫細菌的產氫過程包括以下三種途徑：丙酮酸脫羧產氫途徑、通過甲酸裂解產氫途徑、通過輔酶I(NADH)的氧化還原

3、平衡調節(jié)作用產氫。氫酶是一類在微生物體內催化放氫與吸氫的酶，在生物發(fā)酵制氫中發(fā)揮重要作用。本文以木糖高效產氫菌Enterobactersp.CN1為研究對象，通過其甲酸代謝產氫、甲酸對木糖產氫的影響、次亞磷酸鈉（HPP）對不同碳源產氫的抑制作用；以及甲酸鹽代謝途徑中甲酸氫裂解酶激活子基因（fhlA）和NiFe氫酶基因(hycEhycG)的克隆、表達以及重組菌株的產氫分析，初步闡述了Enterobactersp.CN1木糖產氫代謝中的甲酸

4、鹽途徑。主要的研究結果如下：以0、10、15、20mM的甲酸為單一碳源，在pH6和pH7下發(fā)酵產氫，發(fā)現(xiàn)生成氫氣的量幾乎等于甲酸的量，而且隨著甲酸濃度的增加，菌體濃度有所下降。同時添加10gL的木糖作為碳源，發(fā)現(xiàn)pH7下的產氫量均高于pH6下的產氫量，并且隨著甲酸濃度的增加，pH6和pH7下的產氫量均有增加且增加量大于甲酸的量；而菌體濃度也隨著甲酸濃度的增加有所增加。進一步的酶抑制劑實驗表明，HPP能完全抑制除甲酸外其他碳源的產氫。表明

5、，甲酸在Enterobactersp.CN1木糖產氫代謝中具有重要的作用，推測Enterobactersp.CN1木糖產氫代謝途徑中可能具有甲酸鹽途徑。為進一步驗證Enterobactersp.CN1中甲酸鹽代謝途徑的存在，利用簡并引物克隆分別獲得了fhlA基因和NiFe氫酶基因的部分片段，并通過重新設計引物獲得了兩個基因的全長開放閱讀框。fhlA基因的全長開放閱讀框含有2058bp堿基對，編碼一個含685個氨基酸的多肽，其預測分子量大

6、小約為77kD，pI為5.80，與其他產氫菌的該基因具有高度的同源性。NiFe氫酶具有大小亞基，大亞基基因（hycE）全長開放閱讀框含有1710bp堿基對，編碼一個含569個氨基酸的蛋白亞基，預測其大小約為64.89kD，pI為6.24。而小亞基基因(hycG)的全長開放閱讀框含有768bp堿基對，編碼一個含255個氨基酸的蛋白亞基，預測其大小約為28.03kD，pI為7.24，這與其他一些菌屬的NiFe氫酶蛋白特征非常相似。進一步的氨