龍眼種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及低溫對(duì)石硤龍眼影響研究.pdf

1、中國(guó)是龍眼主要起源地之一，存在許多性狀優(yōu)良的野生和實(shí)生資源，雖然目前對(duì)龍眼資源的遺傳多樣性有較多的研究報(bào)道，但主要集中于國(guó)內(nèi)栽培品種之間，對(duì)國(guó)外品種及國(guó)內(nèi)龍眼非栽培資源研究不多。為此，本研究收集了大量野生和實(shí)生的龍眼資源，分析其遺傳多樣性，探明其親緣關(guān)系，為龍眼資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。近年來(lái)，低溫寒凍害造成龍眼大面積死亡的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給龍眼生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。石硤龍眼是我國(guó)的主栽品種之一，但低溫對(duì)石硤龍眼影響的研究深度不夠。為了更進(jìn)一步

2、探討低溫對(duì)石硤龍眼的影響，本研究從生理生化和分子水平探討低溫脅迫對(duì)石硤龍眼的影響，為龍眼栽培和抗寒育種提供依據(jù)。主要研究結(jié)論如下：
　　 1、龍眼資源遺傳多樣性分析
　　 利用SCoT和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)3個(gè)省區(qū)及越南、泰國(guó)的龍眼種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)非栽培資源與栽培品種之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，中國(guó)龍眼基因資源豐富，泰國(guó)和越南的基因型龍眼分別聚類于2個(gè)不同的遺傳類且遺傳多樣性較低。龍荔和龍眼之間的親

3、緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 2、低溫脅迫對(duì)龍眼生理生化特性的影響
　　 以龍眼幼苗為材料，研究低溫脅迫對(duì)龍眼生理生化指標(biāo)的影響。在低溫脅迫期間，各保護(hù)酶類、脯氨酸和可溶性蛋白含量呈先上升再下降的趨勢(shì)；滲透物質(zhì)可溶性糖含量一直呈上升趨勢(shì)；相對(duì)含水量下降，電導(dǎo)率在達(dá)到最大值后急劇下降，MDA含量在處理前期處于較高水平；低溫脅迫8小時(shí)前，對(duì)光合作用的影響以氣孔限制為主，之后以非氣孔限制為主，上述所測(cè)定的指標(biāo)與龍眼低溫脅迫呈顯著或極顯著

4、相關(guān)。經(jīng)主成分分析表明，前3個(gè)主成分包括的抗寒評(píng)價(jià)指標(biāo)(保護(hù)酶類、膜透性和葉綠素?zé)晒鈪?shù))可以進(jìn)行抗寒性分析，可作為龍眼抗寒性評(píng)價(jià)的依據(jù)。另外，通過(guò)綜合分析表明，4℃低溫處理12小時(shí)內(nèi)，可作為龍眼幼苗抗寒鍛煉的適宜條件。
　　 3、龍眼響應(yīng)低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 建立了龍眼葉片總蛋白雙向電泳體系，從蛋白質(zhì)水平研究龍眼幼苗對(duì)低溫的響應(yīng)機(jī)制。從2-DE圖譜獲得了700多個(gè)有效蛋白質(zhì)點(diǎn)，表達(dá)量差異在2倍以上有45個(gè)差異

5、蛋白點(diǎn)，其中有36.7%的蛋白上調(diào)表達(dá)，63.3%的蛋白被下調(diào)表達(dá)。質(zhì)譜鑒定出31個(gè)蛋白，它們主要是參與光合作用、自由基清除、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白加工和基礎(chǔ)代謝的蛋白。
　　 4、抗寒相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析
　　 應(yīng)用RT-PCR和RACE方法克隆了蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的光合放氧33 kD蛋白、鋅指蛋白、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、景天庚酮-1，7-二磷酸酶、Rubisco活化酶、泛素蛋白、磷酸核酮糖激酶、谷氨酰胺合成酶

6、、熱激蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、14-3-3蛋白、葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶、咖啡酰輔酶A甲基轉(zhuǎn)移酶、碳酸酐酶、水通道蛋白、鈣依賴型蛋白激酶蛋白基因cDNA全長(zhǎng)，并同源克隆了葉綠素a/b結(jié)合蛋白1、葉綠素a/b結(jié)合蛋白2、葉綠素a/b結(jié)合蛋白4和CBF基因cDNA全長(zhǎng)。其中10個(gè)基因成功在大腸桿菌中表達(dá)，獲得相應(yīng)外源蛋白，并對(duì)熱激蛋白經(jīng)Western-blot驗(yàn)證確認(rèn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)獲得的基因進(jìn)行了低溫脅迫下時(shí)空表達(dá)模式分析，結(jié)

7、果顯示所有的基因在低溫下均發(fā)生變化，但各基因的變化規(guī)律不同，如磷酸核酮糖激酶、泛素蛋白、Rubisco活化酶、谷氨酰胺合成酶、14-3-3蛋白、光合放氧33 kD蛋白、水通道蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、碳酸酐酶等基因在低溫脅迫前期的變化較大，可能與各基因參與低溫脅迫時(shí)的功能有關(guān)。已獲得的cDNA全長(zhǎng)中有43.8%在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)相一致，56.2%的基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)并沒(méi)有直接伴隨在蛋白水平的表達(dá)。
　　 5、抗寒相