畢業(yè)論文-生物預處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的初步研究

1、<p>　　生物預處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的初步研究</p><p>　　系 （部）：XXXXXXXXX</p><p>　　專 業(yè) 班：XXXXXXX</p><p>　　姓 名：XXX</p><p>　　學 號：XXXXXXXX</p><p><b>　　指導教師：XXX</b&g

2、t;</p><p><b>　　2013年 5月</b></p><p>　　生物預處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的初步研究</p><p>　　A Preliminary Study of The Biological Pretreatment Straw to Energy</p><p><b>　　摘 要<

3、/b></p><p>　　白腐菌是目前已知的降解木質(zhì)素最強的微生物，但白腐菌直接對秸稈進行預處理所得到的糖化率和乙醇的產(chǎn)量并不高。國外研究顯示，利用白腐菌對秸稈等草類原料進行固體發(fā)酵處理，可以對木質(zhì)素進行選擇性降解，直接攻擊胞間層中的木質(zhì)素，導致纖維的分離。目前，國內(nèi)利用白腐菌的生物降解研究大都處于實驗室階段。</p><p>　　前期研究通過對自然界微生物天然腐朽過程的模擬和改造

4、，建立了一個可用于秸稈轉(zhuǎn)化乙醇、油脂等生物能源的仿生預處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)的處理效率是目前同類報道中最高的。為了顯著提高白腐菌秸稈預處理優(yōu)化所得的糖化率，本研究對白腐菌預處理秸稈的這一系統(tǒng)進行了條件優(yōu)化以增強系統(tǒng)穩(wěn)定性，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容包括：開放條件下生物預處理研究；生物預處理體系穩(wěn)定性的研究；影響生物預處理穩(wěn)定性的主要因素。論文選擇改變白腐菌預處理秸稈系統(tǒng)的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、是否通氧以及培養(yǎng)基中K+、Mn2+、Ca2

5、+、Cu2+等離子的添加，采用分光光度計計算測定其糖化率，得到可以提高白腐菌預處理秸稈產(chǎn)生的還原糖的量的5個優(yōu)化的因子,即：在28℃溫度條件下培養(yǎng)4周、通氧并添加低濃度Mn2+離子，提供更高的培養(yǎng)基濕度，可以提高白腐菌預處理秸稈轉(zhuǎn)化能源的效率。</p><p>　　關(guān)鍵詞：白腐菌 秸稈預處理 優(yōu)化 糖化率</p><p>　　Abstract </p><p>　

6、　Because of reduced energy and less pollution, biological pretreatment attracts a wide spread attention.The biological degradation of lignin in corn straw with white rot fungi is the most effective fungi among Microbe.Ov

7、erseas studies have shown that white rot fungi the solid fermentation processing the raw material of straw and other grasses, selective degradation of lignin, a direct attack on the lignin in the cell between layers, res

8、ulting in separation of the fiber.Currently,the domestic use </p><p>　　Key words: white rot fungi pretreatment optimization saccharification rate</p><p><b>　　目 錄</b></p>&

9、lt;p><b>　　摘要Ⅰ</b></p><p>　　AbstractⅡ</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 秸稈的利用現(xiàn)狀和結(jié)構(gòu)特征1</p><p>　　1.1.1 木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和組成1</p><p>

10、;　　1.1.2 木質(zhì)纖維素的生物降解與酶解2</p><p>　　1.2 白腐菌及其研究3</p><p>　　1.2.1 白腐菌簡介3</p><p>　　1.2.2 白腐菌降解研究進展4</p><p>　　1.3 秸稈預處理技術(shù)5</p><p>　　1.3.1 理化預處理工藝5<

11、/p><p>　　1.3.2 生物預處理工藝6</p><p>　　1.3.3 秸稈白腐菌預處理及存在的問題6</p><p>　　1.3.4 纖維質(zhì)乙醇的研究及其存在的技術(shù)屏障6</p><p>　　1.4 課題思路的提出與設(shè)計7</p><p>　　1.4.1 課題設(shè)計路線7</p>

12、<p>　　1.4.2 因子的選擇7</p><p>　　2 白腐菌預處理秸稈溫度和通氧的優(yōu)化8</p><p>　　2.1 實驗材料8</p><p>　　2.1.1 菌株8</p><p>　　2.1.2 纖維素酶8</p><p>　　2.1.3 主要藥品與試劑8</p&g

13、t;<p>　　2.1.4 生物質(zhì)來源與準備8</p><p>　　2.1.5 培養(yǎng)基8</p><p>　　2.2 實驗方法9</p><p>　　2.2.1 菌株的活化與制備9</p><p>　　2.2.2 白腐菌預處理秸稈的不同溫度和氧氣條件9</p><p>　　2.2.3

14、 取樣時間與方法9</p><p>　　2.2.4 生物質(zhì)酶解糖化9</p><p>　　2.2.5 還原糖測定方法10</p><p>　　2.2.6 木質(zhì)纖維素含量測定12</p><p>　　2.3 結(jié)果與分析12</p><p>　　3 白腐菌預處理秸稈多因子的進一步優(yōu)化14</p&

15、gt;<p>　　3.1 實驗材料14</p><p>　　3.1.1 菌株14</p><p>　　3.1.2 纖維素酶14</p><p>　　3.1.3 主要藥品與試劑14</p><p>　　3.1.4 生物質(zhì)來源與準備14</p><p>　　3.1.5 培養(yǎng)基14<

16、;/p><p>　　3.2 實驗方法16</p><p>　　3.2.1 菌株的活化與制備16</p><p>　　3.2.2 白腐菌預處理秸稈的不同因子培養(yǎng)基的處理16</p><p>　　3.2.3 取樣時間與方法16</p><p>　　3.2.4 生物質(zhì)酶解糖化16</p><

17、;p>　　3.2.5 還原糖測定方法17</p><p>　　3.2.6 木質(zhì)纖維素含量測定18</p><p>　　3.3 結(jié)果與分析19</p><p><b>　　結(jié)論21</b></p><p><b>　　致謝22</b></p><p>&l

18、t;b>　　參考文獻23</b></p><p><b>　　附錄25</b></p><p><b>　　1 緒 論</b></p><p>　　1.1 秸稈的利用現(xiàn)狀和結(jié)構(gòu)特征</p><p>　　我國農(nóng)作物秸稈資源大部分被作為農(nóng)戶生活燃料或在田間焚燒或被棄置亂堆,不僅造成

19、了秸稈資源的嚴重浪費,而且還導致了環(huán)境的污染。通過對全國的秸稈資源產(chǎn)量及分布狀況的調(diào)查與分析,可知不同種類的秸稈產(chǎn)量及分布有明顯的地區(qū)性差異。全國各種主要作物秸稈占總量的比例順序為:稻谷秸稈最高,其次是玉米秸稈和小麥秸。全國秸稈產(chǎn)量超過2500萬噸的省份有山東、河南等8個。此外,對8個省市秸稈利用現(xiàn)狀的調(diào)查研究結(jié)果表明：目前各類秸稈用作燃料的比例仍較高,用作飼料和肥料的比例有所增加,但焚燒、棄置亂堆的現(xiàn)象仍然存在;秸稈用于飼料的比例以甘

20、肅、山東、青海3省最高,超過了25%。通過對全國草食家畜存欄量及粗飼料產(chǎn)量的草畜平衡分析可看出,目前我國的粗飼料缺口較大,僅靠人工種草和天然草地的牧草供給是遠遠不夠的。因此,利用秸稈來補充短缺的粗飼料以保證畜牧業(yè)的穩(wěn)定持續(xù)發(fā)展就顯得十分重要。針對我國秸稈利用現(xiàn)狀,作者提出了因地制宜、依靠先進的現(xiàn)代科技來利用秸稈資源,提高秸稈的利用率、擴大秸稈的利用途徑、增加秸稈的附加值,從而有效滿足畜牧業(yè)的發(fā)展需求。</p><p&

21、gt;　　狹義上，生物質(zhì)（biomass）指木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，它們是地球上最豐富的光合產(chǎn)物，來源非常廣泛，包括所有植物的根、莖、葉、果殼等部分。生物質(zhì)產(chǎn)量大且類型多，農(nóng)作物秸稈是其主要來源之一。我國農(nóng)作物秸稈、皮殼等產(chǎn)量每年高達7億多噸，資源十分豐富，其中玉米秸稈、小麥秸稈和稻草是最主要的三大秸稈[1]，僅玉米秸稈年產(chǎn)量大約3億噸。目前，大量的農(nóng)作物秸稈除少部分被利用外，大部分以堆積、焚燒等形式直接傾入環(huán)境，造成嚴重的環(huán)境污染與資源浪費

22、。秸稈作為地球上豐富的可再生資源,其成分主要是木質(zhì)素、纖維素、半纖維素 [2]。</p><p>　　1.1.1 木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和組成</p><p>　　木質(zhì)纖維素（lignocellulose）是生物質(zhì)的主要組分，由纖維素（cellulose）、半纖維素（hemicellulose）和木質(zhì)素（lignin）三種成分以各種比例組成的高分子復合物，不同組分含量比例因生物質(zhì)種類而異[3]。

23、</p><p>　　木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過醚鍵和碳-碳鍵連接而成的具有三維空間結(jié)構(gòu)的高分子芳香類聚合物, 難以被酸水解,對酶的水解呈抗性,是公認的難降解物質(zhì)[4]。木質(zhì)素廣泛存在于較高等的維管束植物中，與纖維素、半纖維素合稱為植物體的“三素”，在自然界的含量僅次于纖維素。</p><p>　　纖維素是由β-1,4-糖苷鍵連接D-葡萄糖單元構(gòu)成的無分支長鏈狀大分子，聚合度大（一般為1

24、000～10000），結(jié)構(gòu)緊密。纖維素在化學組成上的重復單元為葡萄糖。纖維素大分子間的結(jié)合鍵主要是氫鍵、范德華力和碳氧鍵。纖維素是豐富的、可再生的天然資源，除紡織、制漿造紙等傳統(tǒng)領(lǐng)域外，采用新技術(shù)制備高附加值產(chǎn)品的研究方興未艾，已在食品、醫(yī)藥、材料等領(lǐng)域開展了許多工作[5]。</p><p>　　半纖維素基本單位是多種戊糖和己糖單體，包括甘露糖、木糖、半乳糖醛、葡萄糖、葡萄糖糖醛酸等。這些單體以不同連接方式組成低

25、分子量的不均一聚糖[6]。</p><p>　　纖維素分子是木質(zhì)纖維素的主要框架結(jié)構(gòu)，半纖維素和木質(zhì)素充斥于纖維骨架之間，將纖維素包裹其中。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)非常復雜，與半纖維素一起填充于纖維素之間或包埋纏繞于其外起加固粘結(jié)的作用，不宜通過水解方式降解，對絕大多數(shù)微生物的攻擊均有抗性。在木質(zhì)纖維素原料中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素以共價鍵及非共價鍵緊密連結(jié)，形成復雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。</p><p>　　

26、1.1.2 木質(zhì)纖維素的生物降解與酶解</p><p>　　纖維素酶(cellulase)是纖維素水解為葡萄糖過程中起到催化作用的各種酶的總稱，因此也被叫做纖維素酶系[7]。從功能方面來看，纖維素酶包括：（1）內(nèi)切葡萄糖苷酶，作用于纖維素內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵，從纖維素鏈上釋放出更多的葡萄糖末端；（2）外切葡萄糖苷酶，作用于纖維素中還原以及非還原位的糖苷鍵，生成纖維二糖；（3）纖維二糖酶,作用于纖維二糖使之水解

27、為葡萄糖。只有在纖維素酶系中這三類酶的共同作用,最終才能把木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)的纖維素水解變成葡萄糖。</p><p>　　在纖維乙醇生產(chǎn)中，纖維素酶對木質(zhì)纖維素原料的酶解效率至關(guān)重要。自然界中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的完全生物降解涉及許多種微生物的作用和酶反應(yīng)機制。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)特征，即木質(zhì)素和半纖維素對纖維素分子的包埋作用（主要是木質(zhì)素）及纖維素分子自身的超分子結(jié)構(gòu)，使纖維素免遭外界化學物質(zhì)或生物酶攻擊[8]。必須通過一

28、定的預處理手段來去除半纖維素和木質(zhì)素，降低纖維素的結(jié)晶度，增大纖維素酶的有效接觸面積，從而提高木質(zhì)纖維素的酶解效率。研究表明，高等真菌，尤其是白色腐朽類的白腐菌，蘊藏著豐富的木質(zhì)素氧化酶系，是自然界中高效降解木質(zhì)素的生力軍[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)7種真菌處理后的木材酶水解率有明顯提高，且最大的提高了4.27倍[10]。</p><p>　　1.2 白腐菌及其研究</p><p>　　1.2.

29、1 白腐菌簡介</p><p>　　白腐菌是一種能夠引起木材白色腐朽的擔子菌類。在所有的能降解木素質(zhì)的微生物中,白腐菌是目前研究最充分的、對木質(zhì)素具有最強降解能力的一類真菌[11]。它可以直接侵入木材的細胞腔內(nèi)，釋放降解木質(zhì)素和其它組分（纖維素、半纖維素、果膠等）的酶，導致木材腐爛成白色海綿狀團塊，故因此而得名。分類上屬于真菌界，絕大多數(shù)為擔子菌，少數(shù)為子囊菌，包括多孔菌、側(cè)耳、香菇等200多個品系。白腐菌的特點

30、是對于木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素的選擇降解能力是最強的，白腐菌分泌的LiP，MnP，Laccase及多酚氧化酶可以將木質(zhì)素徹底的礦化成二氧化碳和水，當然白腐菌對纖維素和半纖維素也有一定的降解能力[12]。</p><p>　　白腐菌屬于擔子菌綱(Basidiomycete)，是少數(shù)的能選擇性降解木質(zhì)素的真菌之一，因其腐生在樹木或木材上，引起木質(zhì)白色腐爛而得此名。目前，已研究的白腐菌有：黃孢原毛平革菌(Phaneroch

31、aete chrysosporium)、彩絨革蓋菌(Coliolus versicolor)、變色栓菌(Trametes versicolor)、射脈菌(Phlebia radiata)、鳳尾菇(Pleurotus pulm onarius)、雜色云芝(Trametes versicolor)、糙皮側(cè)耳(Pleurotus)、朱紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)等。P.chrysosporium 已成為研究木質(zhì)素

32、降解的模式菌株[13]。白腐菌所分泌的木質(zhì)素降解酶主要有3種，即木質(zhì)素過氧化酶、錳過氧化物酶和漆酶。白腐菌在降解木材的過程中，在適宜的條件下，白腐菌菌絲開始沿著細胞腔蔓延，主要集中在紋孔處。在菌絲下細胞壁被分解出一條溝槽，它可從細胞腔到復合胞間層，逐漸降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。白腐菌降解木質(zhì)素可分為細胞內(nèi)和細胞外2個過程。在細胞內(nèi)主要營養(yǎng)物質(zhì)(碳、氮、硫)限</p><p>　　1.2.2 白腐菌降解研究進展

33、</p><p>　　自然界參與降解木質(zhì)素的微生物種類有真菌、放線菌和細菌等，但迄今為止最有效、最主要的木質(zhì)素降解微生物，可徹底降解木質(zhì)素為CO2和H2O的是白腐真菌。以木材的腐朽類型，木質(zhì)纖維素降解真菌可分為3類：白腐菌(White rot fungi)、褐腐菌(Brown rot fungi)和軟腐菌(Soft rot fungi) [16]。其中褐腐菌只能攻擊和降解細胞壁中的纖維素、半纖維素部分，而軟腐菌僅

34、作用于細胞中的半纖維素，只有白腐菌是自然界中唯一一類具有獨立降解木質(zhì)素能力的微生物，褐腐菌、軟腐菌一般認為在木素降解中僅起二次性作用。白腐菌分泌木質(zhì)素降解酶的同時還分泌纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等酶類，因而比木霉、曲霉等更適合分解天然的木質(zhì)纖維素物質(zhì)。纖維素是植物細胞壁的主要成分，廣泛而大量地存在于自然界，是地球上最豐富、最廉價的可再生資源，也是人類未來可能的能源、食品和化工原料的主要來源。利用纖維素酶將纖維原料轉(zhuǎn)化成可利用的糖，對于

35、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實施具有重大意義[17]。</p><p>　　目前白腐菌降解木質(zhì)素的模式菌株是黃孢原毛平革菌。秸稈經(jīng)白腐真菌發(fā)酵后，大部分的低質(zhì)非蛋白氮轉(zhuǎn)化為較高質(zhì)量的菌體蛋白，蛋白質(zhì)品質(zhì)也得到較大幅度的改進。秸稈經(jīng)白腐菌處理不僅營養(yǎng)成分有極大的提高，而且其pH值由未處理前的5.7降到4.0，呈愉快的水果香味，同時由于大部分的木質(zhì)素被降解或破壞，秸稈質(zhì)地柔軟，適口性明顯改善；可提高動物對飼料的消化，并且已經(jīng)突破

36、了秸稈僅用于反芻動物飼料的禁區(qū)，對飼養(yǎng)豬、雞的實驗效果已有報道。利用白腐真菌處理秸稈能夠快速、高質(zhì)量地利用和轉(zhuǎn)化秸稈資源，擴大飼料來源，減少環(huán)境污染[18]。白腐菌的木素降解酶類能選擇分解植物秸稈中的木質(zhì)素，使得生物制漿成為可能。生物制漿是直接利用微生物降解纖維原料中的木質(zhì)素，分離出纖維，使之成為紙漿[19]。這種方法不僅能節(jié)約能耗，改善紙張的物理性能，還能減少污染，保護環(huán)境，應(yīng)用前景廣闊。隨著對木質(zhì)素降解機理認識的深入，白腐菌在生物制

37、漿、生物漂白、染料脫色、木質(zhì)素轉(zhuǎn)化、食品飲料、飼料原料以及廢水、廢物處理等方面將發(fā)揮重要作用[20]。</p><p>　　國外研究顯示，利用白腐菌對秸稈等草類原料進行固體發(fā)酵處理，可以對木質(zhì)素進行選擇性降解，直接攻擊胞間層中的木質(zhì)素，導致纖維的分離。目前，國內(nèi)利用白腐菌的生物降解研究大都處于實驗室階段[21]。</p><p>　　1.3 秸稈預處理技術(shù)</p><p

38、>　　天然生物質(zhì)的抗性問題，是制約纖維質(zhì)乙醇發(fā)展的主要瓶頸問題之一，而預處理技術(shù)是解決這一瓶頸的重要途徑。預處理工藝的選擇一般要遵循以下幾條：（1）提高可還原性糖的釋放量；（2）避免纖維素的降解和損失；（3）避免副產(chǎn)物的生成，以免影響后續(xù)的酶解和乙醇發(fā)酵；（4）廉價而有效。常用的秸稈預處理技術(shù)包括物理預處理、化學預處理、生物預處理以及聯(lián)合預處理技術(shù)[8]。</p><p>　　1.3.1 理化預處理工藝&l

39、t;/p><p>　　常見的物理預處理方法包括：機械破碎法、蒸汽爆破、微波處理、高壓水煮法[15]等。機械粉碎預處理既是采用粉碎機等機械對木質(zhì)纖維原料進行切割、粉碎、研磨，增大纖維素的微表面積，降低結(jié)晶區(qū)的結(jié)晶度，從而更易與纖維素酶接觸，但這類方法不能去除木質(zhì)素。再如蒸汽爆破預處理是通過高壓蒸汽加熱原料到150~220℃，作用20min左右，突然降低壓力，產(chǎn)生二次蒸汽，在木質(zhì)纖維原料內(nèi)部產(chǎn)生強機械力作用，破壞木質(zhì)纖維

40、結(jié)構(gòu)，分解了大部分半纖維素和少部分木素，使得纖維素暴露出來，更易與纖維素酶作用，但這個過程中會產(chǎn)生可能影響后續(xù)酶解糖化和乙醇發(fā)酵的醛類和酸類副產(chǎn)物。</p><p>　　常見的化學預處理方法包括堿處理，酸處理，有機溶劑預處理，臭氧預處理[16]等。通過堿液可以破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，使其變成容易溶解的羥基木質(zhì)素，在基本不損失半纖維素和纖維素的前提下去除木質(zhì)素。而高溫酸預處理則是通過破壞纖維素的結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)和水解半纖維素，使

41、木質(zhì)纖維原料變得更加疏松，更容易得到充分利用。</p><p>　　1.3.2 生物預處理工藝</p><p>　　物理預處理工藝的過程方法較為簡單，對環(huán)境污染較小，但能耗較高，成本較高?；瘜W預處理能耗較小、效率較高。但對設(shè)備的要求高，殘留的化學試劑需要處理，且易造成污染。但是生物預處理工藝是節(jié)能減排的環(huán)境友好型的預處理工藝，其能耗也低。</p><p>　　生物方

42、法脫木質(zhì)素有成本低、污染輕的優(yōu)點,已成為國際開發(fā)利用纖維資源的熱門課題,近年來,人們對高效木質(zhì)素降解菌的篩選和分離做了大量的工作。白腐菌是目前研究得最為廣泛的木質(zhì)素降解菌種,研究表明,白腐菌是降解木質(zhì)素類芳香化合物能力最強的微生物[18]。</p><p>　　1.3.3 秸稈白腐菌預處理存在的問題</p><p>　　雖然生物預處理是環(huán)境友好型且低能耗的預處理技術(shù)，但是目前還是存在著很多

43、問題，處理周期長是第一大問題。除此之外，還有生物預處理需要在生物反應(yīng)器中進行，其接種制種成本也較高。和理化預處理相比，其最大的問題便是糖轉(zhuǎn)化率較低。所以，如何提高其糖轉(zhuǎn)化率變成了目前大家比較關(guān)注的問題。</p><p>　　1.3.4 纖維質(zhì)乙醇的研究及其存在的技術(shù)屏障</p><p>　　在石油、煤炭等化石能源日益枯竭的今天，乙醇作為一種可以直接添加在汽油中的可再生清潔燃料，已成為新能源

44、的發(fā)展重點。目前，我國是世界上繼巴西、美國之后第三大燃料乙醇生產(chǎn)國。</p><p>　　木質(zhì)纖維素作為一種分布廣泛、產(chǎn)量巨大的可再生資源，其中所富含的纖維素和半纖維素等多糖類物質(zhì)可以在纖維素酶和酵母的作用下水解為單糖繼而轉(zhuǎn)化為乙醇即纖維質(zhì)乙醇。木質(zhì)纖維素是植物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)框架，其來源包括木材、草類、農(nóng)業(yè)殘渣、森林廢棄物等，是地球上最豐富的生物質(zhì)之一。因此，利用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)纖維質(zhì)乙醇逐漸成為當前乙醇產(chǎn)業(yè)

45、發(fā)展的主要方向。</p><p>　　生物質(zhì)轉(zhuǎn)化乙醇主要是利用的纖維素產(chǎn)生的還原糖，再用酵母發(fā)酵得到乙醇，而木質(zhì)纖維素對生物轉(zhuǎn)化的高抗性導致高昂的生產(chǎn)成本，使其規(guī)模化生產(chǎn)受到限制。在木質(zhì)纖維素中，木質(zhì)素是限制酶解的最為重要的抗性因子，其在酶解中的作用尤其值得關(guān)注[14]。所以，其預處理難點在于怎樣提高木質(zhì)素的降解而降低纖維素的降解，進而提高木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率、實現(xiàn)纖維質(zhì)乙醇的商業(yè)化生產(chǎn)。</p>

46、<p>　　1.4 課題思路的提出與設(shè)計</p><p>　　纖維乙醇作為一種可再生的替代能源，越來越受到重視，纖維素預處理技術(shù)對纖維素資源的利用及乙醇生產(chǎn)成本的控制起著重要作用。與物理方法和化學方法相比，生物預處理可實現(xiàn)溫和條件下有效減弱生物質(zhì)抗性、提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率。而白腐菌是目前已知的降解木質(zhì)素最強的微生物，所以白腐菌預處理秸稈優(yōu)化條件的篩選就顯得尤為重要。鑒于此，本次畢業(yè)設(shè)計將通過多因子優(yōu)化的實

47、驗篩選出開放條件下白腐菌預處理秸稈培養(yǎng)的目標因子。</p><p>　　1.4.1 課題設(shè)計路線</p><p>　　圖1-1 課題設(shè)計路線圖</p><p>　　1.4.2 因子的選擇</p><p>　　由于溫度、氧氣、濕度是影響白腐菌生長的基本生長條件，麩皮、酵母、Cu2+、Fe2+、K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+和Mg2+是影響白

48、腐菌營養(yǎng)供給的基本因子，可知這些因子和指標對白腐菌的營養(yǎng)生長和新陳代謝具有重要影響。</p><p>　　因此，根據(jù)對白腐菌生長和其降解木質(zhì)素的酶的影響，結(jié)合前期研究成果及他人研究結(jié)論，選取了溫度、氧氣、濕度、麩皮、酵母、Cu2+、Fe2+、K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+和Mg2+作為供選因子。通過測定糖化率、酶活以及不同條件處理后秸稈的組分進行分析比較以篩選出最優(yōu)的條件。</p><p&

49、gt;　　2 白腐菌預處理秸稈溫度與通氧的優(yōu)化</p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌株</b></p><p>　　Irpex lacteus CD2，乳白耙菌，采集、分離自神農(nóng)架。其種屬是通過對該真菌rRNA上的序列ITS(Internal Transcribe

50、d Spacer)擴增測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源比對分析來確定的。</p><p>　　2.1.2 纖維素酶</p><p>　　無錫雪酶，來源于無錫市雪梅酶制劑科技有限公司。具有纖維素和半纖維素活性，總纖維素酶活(FPU)為30FPU/g。</p><p>　　2.1.3 主要藥品與試劑</p><p>　　（1）3,5-二硝基水楊酸

51、試劑(DNS)：182g酒石酸鉀鈉溶于500mL熱水中，先加入3,5-二硝基水楊酸6.3g與2M氫氧化鈉溶液262mL，最后再加重結(jié)晶酚5g和NaHSO3 5g攪拌溶解，冷卻后定容到1000mL，貯于棕色瓶中，一周后可用。</p><p>　?。?）pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液：100mL0.2M的醋酸與150mL0.2M的醋酸鈉混合后，定容到1000mL。</p><p>　　（3）纖

52、維素酶液：取10g纖維素粗酶于1000mLpH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用玻璃棒攪拌均勻后置于50℃水浴鍋中每隔半小時攪拌一次，5小時后取出放冰箱中過夜。第二天用真空泵隔三層濾紙抽濾后，取抽濾液和緩沖液按1:1混合。再按千分之一的量加疊氮化鈉。</p><p>　　2.1.4 生物質(zhì)來源與準備</p><p>　　玉米秸稈來源于湖北麻城采集后曬干、粉碎，保存于干燥通風處；使用之前分別用2

53、0目和60目篩網(wǎng)分級，收集粒度介于20目～60目之間的粉末用于后續(xù)研究。</p><p><b>　　2.1.5 培養(yǎng)基</b></p><p>　?。?）菌株活化培養(yǎng)基：PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH自然。</p><p>　?。?）秸稈平板培養(yǎng)基：17g秸稈與

54、3g麩皮與水按固液比1:2.5加水，用手抓勻，平鋪在平板，壓實。</p><p>　　（3）液體種子培養(yǎng)基：PDB(Potato Dextrose Broth)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，pH自然。</p><p>　　（4）玉米秸稈固體接種體：按照玉米秸稈:水＝1:2.5 的比例配制，每只250mL的三角瓶裝2g，報紙和塑料膜包扎，121℃滅菌30min備用。</

55、p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 菌株的活化與制備</p><p>　　（1）菌株活化：取出保存的PDA菌種，挑出一塊置于平板上，28℃培養(yǎng)3~4d，備用。</p><p>　?。?）液體種子制備：用滅菌后的接種針挑取2~3小塊活化的菌種，置于PDB培養(yǎng)基中，28℃下，150r

56、/min搖床培養(yǎng)6d，備用。</p><p>　　2.2.2 白腐菌預處理秸稈的不同溫度與通氧條件</p><p>　　將制好的液體種子吸去PDB上清液，用無菌接種管吸取2mL菌球均勻的灑在已準備好的玉米秸稈固體接種體培養(yǎng)基上。將三角瓶封口，分別于28℃，32℃，37℃環(huán)境下培養(yǎng)。每個溫度放置6瓶。氧氣的培養(yǎng)瓶（磨口瓶，連有磨口三通管，用封口膜封閉）放在28℃環(huán)境下，每三天通氧一次，每次1

57、0min。</p><p>　　2.2.3 取樣時間與方法</p><p>　　分別于培養(yǎng)后的2，4，6周取出樣品進行烘干酶解糖化及后續(xù)試驗，每個樣品做兩個平行。</p><p>　　2.2.4 生物質(zhì)酶解糖化</p><p>　　白腐菌處理后的秸稈于60℃烘箱烘72h，稱取并計算其質(zhì)量損失。用兩種方法對其進行酶解。</p>&

58、lt;p>　?。?）取0.160g預處理后烘干的秸稈粉末，加入制好的纖維素酶液8mL，使固液比例達到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過濾，棄濾渣，濾液用于測定還原糖含量。</p><p>　?。?）按0.160g乘以相應(yīng)樣品的質(zhì)量損失稱取秸稈粉末，加入制好的纖維素酶液 8mL，使固液比例達到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過濾，棄濾渣，

59、濾液用于測定還原糖含量。</p><p>　　轉(zhuǎn)化率（Transformation Rate，TR）反映了單位質(zhì)量生物質(zhì)酶解釋放可發(fā)酵糖的能力，因此用轉(zhuǎn)化率變化表示不同條件下菌株對生物質(zhì)的改性程度。以酶解轉(zhuǎn)化得到的還原糖質(zhì)量占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示各樣品轉(zhuǎn)化率，公式為：</p><p><b>　?。?.1）</b></p><p>　　糖

60、化率（Saccharification Rate，SR）為各條件下菌株處理后生物質(zhì)糖化的還原糖量占菌株處理前生物質(zhì)中能源底物的比例，能源底物指能被轉(zhuǎn)化為單糖的綜纖維素（纖維素和半纖維素）。糖化率的計算與定義考慮了各菌株預處理造成的生物質(zhì)質(zhì)量損失，公式為：</p><p>　?。?.2）2.2.5 還原糖測定方法</p><p>　　DNS法(二硝基水楊酸法) [22]：堿性條件下二硝基水楊

61、酸（DNS）與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，可用比色法測定。因其顯色的深淺只與糖類游離出還原基團的數(shù)量有關(guān)，而對還原糖的種類沒有選擇性，故DNS方法適合用在多糖（如纖維素、半纖維素和淀粉等）水解產(chǎn)生的多種還原糖體系中。</p><p>　　取1.5mL適當稀釋的待測液，加入2mLDNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速

62、流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測定吸光值，根據(jù)樣品吸光值及葡萄糖標準曲線計算樣品中還原糖含量。同時設(shè)1.5mL蒸餾水與2mLDNS的空白對照。以葡萄糖為參照制作標準曲線：取11支螺口具塞試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL葡萄糖標準溶液（0.5mg/mL），用蒸餾水補足至1.5mL，加入2mLDNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測定吸光值。以

63、吸光值為橫坐標、葡萄糖濃度為縱坐標制作葡萄糖標準曲線（如圖2-1，圖2-2，圖2-3）。</p><p>　　圖2-1 葡萄糖標準曲線1（計質(zhì)量損失）</p><p>　　圖2-2 葡萄糖標準曲線2（計質(zhì)量損失）</p><p>　　圖2-3 葡萄糖標準曲線3（不計質(zhì)量損失）</p><p>　　2.2.6 木質(zhì)素含量測定</p>

64、<p>　　參考Goering法（格林法）和 Van Soest 法（凡氏法）[23]測定固體生物質(zhì)樣品中纖維素與半纖維素含量，纖維素為72%硫酸消化的部分，半纖維素為中性洗滌纖維NDF與酸性洗滌纖維ADF含量之差；參考美國可再生能源實驗室（NREL）方法[24]測定酸不溶木質(zhì)素（Acid Insoluble Lignin，AIL）、酸溶木質(zhì)素（Acid Soluble Lignin，ASL）及酸不溶灰分含量，木質(zhì)素含量為

65、AIL與ASL之和。（受時間限制，木質(zhì)纖維素含量暫未測定。）</p><p>　　2.3 實驗結(jié)果與分析</p><p>　　對每個樣品測其還原糖，結(jié)果如下（圖2-4，圖2-5）：</p><p>　　注：不計算質(zhì)量損失可得糖化率，以處理前后的樣品質(zhì)量為標準得到。</p><p>　　圖2-4 氧氣溫度因素處理秸稈不同時間內(nèi)酶解所得還原糖含量

66、（不計質(zhì)量損失）</p><p>　　圖2-4顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，每克秸稈所得的還原糖的量逐漸增加，但第2周-第4周增長的速率明顯大于第4周-第6周，所以結(jié)合培養(yǎng)時間和增長速率綜合考慮，培養(yǎng)4周是較理想的培養(yǎng)時長。圖2-4還可表明，氧氣的添加是可以明顯促進白腐菌預處理秸稈所得的還原糖的量的因素，故通氧是比較可行的提高白腐菌預處理秸稈所得還原糖量的方式。</p><p>　　注：計算質(zhì)

67、量損失可得絕對糖化率，以處理前后的樣品質(zhì)量為標準得到。</p><p>　　圖2-5 氧氣溫度因素處理秸稈不同時間內(nèi)酶解所得還原糖含量（計質(zhì)量損失）</p><p>　　由圖2-5可看出，當考慮質(zhì)量損失時，雖然總的還原糖的變化趨勢沒有改變，但是其轉(zhuǎn)化率以及還原糖的量是有變化的。所以后續(xù)試驗可以通過組分的測定來明確質(zhì)量損失的是哪種具體的成分，以期發(fā)現(xiàn)白腐菌對秸稈木質(zhì)纖維素各組分的利用情況。&

68、lt;/p><p>　　綜上所述，通過對不同溫度和氧氣處理下白腐菌預處理秸稈的效果可得28℃下培養(yǎng)4周為白腐菌預處理秸稈的最優(yōu)條件，在此條件下處理后玉米秸稈的還原糖的量可達321.8726mg/g。而在該條件下通氧處理后玉米秸稈的還原糖的量可達335.4663mg/g。所以該部分試驗篩選出兩個影響因素分別為溫度28℃和通氧，同時確定了最佳取樣時長為4周。</p><p>　　3 白腐菌預處理秸

69、稈多因子的進一步優(yōu)化</p><p><b>　　3.1 實驗材料</b></p><p><b>　　3.1.1 菌株</b></p><p>　　Irpex lacteus CD2，乳白耙菌，采集、分離自神農(nóng)架。其種屬是通過對該真菌rRNA上的序列ITS(Internal Transcribed Spacer)擴增測序

70、，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源比對分析來確定的。</p><p>　　3.1.2 纖維素酶</p><p>　　無錫雪酶，來源于無錫市雪梅酶制劑科技有限公司。具有纖維素和半纖維素活性，總纖維素酶活(FPU)為30FPU/g。</p><p>　　3.1.3 主要藥品與試劑</p><p>　　(1)3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)：182g酒

71、石酸鉀鈉溶于500mL熱水中，先加入3，5-二硝基水楊酸6.3g與2M氫氧化鈉溶液262mL，最后再加重結(jié)晶酚5g和NaHSO3 5g攪拌溶解，冷卻后定容到1000mL，貯于棕色瓶中，一周后可用。</p><p>　　（2）pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液：100mL0.2M的醋酸與150mL0.2M的醋酸鈉混合后，定容到1000mL。</p><p>　?。?）纖維素酶液：取10g纖維素粗

72、酶于1000mL pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用玻璃棒攪拌均勻后置于50℃水浴鍋中每隔半小時攪拌一次，5小時后取出放冰箱中過夜。第二天用真空泵隔三層濾紙抽濾后，取抽濾液和緩沖液按1:1混合。再按千分之一的量加疊氮化鈉。</p><p>　　3.1.4 生物質(zhì)來源與準備</p><p>　　玉米秸稈來源于湖北麻城采集后曬干、粉碎，保存于干燥通風處；使用之前分別用20目和60目篩網(wǎng)分級，收

73、集粒度介于20目～60目之間的粉末用于后續(xù)研究。</p><p><b>　　3.1.5 培養(yǎng)基</b></p><p>　　（1）菌株活化培養(yǎng)基（秸稈平板）：PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH自然。</p><p>　?。?）液體種子培養(yǎng)基：PDB(Potato D

74、extrose Broth)培養(yǎng)基(g/L)，土豆200g，葡萄糖20g，pH自然。</p><p>　　（3）白腐菌預處理秸稈的各優(yōu)化培養(yǎng)基（見表3-1）：</p><p>　　表3-1 不同因子條件下處理的培養(yǎng)基</p><p><b>　　3.2 實驗方法</b></p><p>　　3.2.1 菌株的活化與制備&

75、lt;/p><p>　　（1）菌株活化：取出保存的PDA菌種，挑出一塊置于平板上，28℃培養(yǎng)3~4d，備用。</p><p>　?。?）液體種子制備：用滅菌后的接種針挑取2~3小塊活化的菌種，置于PDB培養(yǎng)基中，28℃下，150r/min搖床培養(yǎng)6d，備用。</p><p>　　3.2.2 白腐菌預處理秸稈不同因子的培養(yǎng)基處理</p><p>　

76、　將制好的液體種子吸去PDB上清液，用無菌接種管吸取2mL菌球均勻的灑在已準備好的玉米秸稈固體接種體培養(yǎng)基上。將三角瓶封口，置于28℃環(huán)境下培養(yǎng)。</p><p>　　3.2.3 取樣時間與方法</p><p>　　于培養(yǎng)后的4周取出樣品進行烘干酶解糖化及后續(xù)試驗，每個樣品做兩個平行。</p><p>　　3.2.4 生物質(zhì)酶解糖化</p><p

77、>　　白腐菌處理后的秸稈于60℃烘箱烘72h，稱取并計算其質(zhì)量損失。用兩種方法對其進行酶解。</p><p>　　（1）取0.160g預處理后烘干的秸稈粉末，加入制好的纖維素酶液8mL，使固液比例達到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過濾，棄濾渣，濾液用于測定還原糖含量。</p><p>　?。?）按0.160g乘以相應(yīng)樣品的質(zhì)量損失稱取秸稈粉末，加

78、入制好的纖維素酶液 8mL，使固液比例達到1:50，于50℃酶解72h，轉(zhuǎn)速100r/min。酶解后用定性濾紙過濾，棄濾渣，濾液用于測定還原糖含量。</p><p>　　轉(zhuǎn)化率（Transformation Rate，TR）反映了單位質(zhì)量生物質(zhì)酶解釋放可發(fā)酵糖的能力，因此用轉(zhuǎn)化率變化表示不同條件下菌株對生物質(zhì)的改性程度。以酶解轉(zhuǎn)化得到的還原糖質(zhì)量占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示各樣品轉(zhuǎn)化率，公式為：</p>

79、;<p><b>　　（3.1）</b></p><p>　　糖化率（Saccharification Rate，SR）為各條件下菌株處理后生物質(zhì)糖化的還原糖量占菌株處理前生物質(zhì)中能源底物的比例，能源底物指能被轉(zhuǎn)化為單糖的綜纖維素（纖維素和半纖維素）。糖化率的計算與定義考慮了各菌株預處理造成的生物質(zhì)質(zhì)量損失，公式為：</p><p>　?。?.2）3.2

80、.5 還原糖測定方法</p><p>　　DNS法[22]，具體方法為：取1.5mL適當稀釋的待測液，加入2mL DNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測定吸光值，根據(jù)樣品吸光值及葡萄糖標準曲線計算樣品中還原糖含量。同時設(shè)1.5mL蒸餾水與2mL DNS的空白對照。以葡萄糖為參照制作標準曲線：取11支螺口具塞試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.

81、8、0.9、1.0mL葡萄糖標準溶液（0.5mg/mL），用蒸餾水補足至1.5mL，加入2mL DNS，沸水浴反應(yīng)10min后迅速流水冷卻以終止反應(yīng)，于540nm測定吸光值。以吸光值為橫坐標、葡萄糖濃度為縱坐標制作葡萄糖標準曲線（見圖3-1，圖3-2，圖3-3）。</p><p>　　圖3-1 葡萄糖標準曲線1（計質(zhì)量損失）</p><p>　　圖3-2 葡萄糖標準曲線2（計質(zhì)量損失）&l

82、t;/p><p>　　圖3-3 葡萄糖標準曲線3（不計質(zhì)量損失)</p><p>　　3.2.6 木質(zhì)素含量測定</p><p>　　參考Goering和 Van Soest 法[23]測定固體生物質(zhì)樣品中纖維素與半纖維素含量，纖維素為72%硫酸消化的部分，半纖維素為中性洗滌纖維NDF與酸性洗滌纖維ADF含量之差；參考美國可再生能源實驗室（NREL）方法[24]測定酸不

83、溶木質(zhì)素（Acid Insoluble Lignin，AIL）、酸溶木質(zhì)素（Acid Soluble Lignin，ASL）及酸不溶灰分含量，木質(zhì)素含量為AIL與ASL之和。</p><p>　　3.3 實驗結(jié)果與分析</p><p>　　對每個樣品測其還原糖，計算后結(jié)果如下（圖3-4，圖3-5）：</p><p>　　注：理論上的質(zhì)量損失是培養(yǎng)前后大部分木質(zhì)素被降

84、解的質(zhì)量以及少部分纖維素被降解的質(zhì)量，一般情況下為20%左右，15%到25%都屬于正常范圍。</p><p>　　圖3-4 不同影響因素作用相同時間酶解產(chǎn)糖分析（不計質(zhì)量損失）</p><p>　　由圖3-4可看出，與空白對照和原料相比，添加了高濃度K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、酵母、麩皮、高濕度和低濃度K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、酵母、麩皮、低濕度的培養(yǎng)

85、條件下，低濃度Mn2+，高濕度的秸稈培養(yǎng)基可以明顯提高白腐菌預處理秸稈產(chǎn)還原糖的量，還原糖產(chǎn)量分別可達369.1037mg/g、312.2477mg/g。</p><p>　　注：理論上的質(zhì)量損失是培養(yǎng)前后大部分木質(zhì)素被降解的質(zhì)量以及少部分纖維素被降解的質(zhì)量，一般情況下為20%左右，15%到25%都屬于正常范圍。</p><p>　　圖3-5 不同影響因素作用相同時間酶解產(chǎn)糖分析(計質(zhì)量損

86、失)</p><p>　　圖3-5表明，當考慮質(zhì)量損失時，雖然總的還原糖的變化趨勢沒有改變，但是其轉(zhuǎn)化率以及還原糖的量是有變化的。所以后續(xù)試驗可以通過組分的測定來明確質(zhì)量損失的是哪種具體的成分，以期發(fā)現(xiàn)白腐菌對秸稈木質(zhì)纖維素各組分的利用情況。</p><p>　　綜上所述，本節(jié)試驗得到的兩個可以明顯提高白腐菌預處理秸稈還原糖得率的優(yōu)化因子為低濃度Mn2+離子和高濕度，此時還原糖的量分別達到

87、369.1037mg/g、312.2477mg/g。即低濃度Mn2+離子和高濕度是本節(jié)試驗篩選出的優(yōu)化因子。 </p><p><b>　　結(jié) 論</b></p><p>　　通過對不同溫度和是否通氧處理下白腐菌預處理秸稈的結(jié)果分析可知，在28℃下培養(yǎng)4周未通氧的條件下處理的玉米秸稈的還原糖的量可達321.8726mg/g，在28℃下培養(yǎng)4周通氧條件處理后玉米秸稈的還

88、原糖的量可達335.4663mg/g。所以該部分試驗篩選出的兩個影響因素分別是溫度28℃和通氧，同時確定了最佳培養(yǎng)時間為4周。通過后續(xù)試驗得到低濃度的Mn2+離子和高濕度這兩個可以明顯提高白腐菌預處理秸稈的還原糖得率的優(yōu)化因子，此時的還原糖的量分別可達369.1037mg/g、312.2477 mg/g，即低濃度Mn2+離子和高濕度是本節(jié)試驗篩選出的優(yōu)化因子。故本畢業(yè)設(shè)計得到的可以提高白腐菌預處理秸稈產(chǎn)還原糖的5個優(yōu)化因子分別是：（1）

89、28℃溫度條件下培養(yǎng)；（2）培養(yǎng)時間為4周；（3）通氧；（4）添加低濃度Mn2+離子；（5）提高培養(yǎng)基的濕度。</p><p>　　本次畢業(yè)設(shè)計發(fā)現(xiàn)經(jīng)白腐菌預處理秸稈后有一定的質(zhì)量損失，且質(zhì)量損失影響轉(zhuǎn)化率，理論上的質(zhì)量損失是培養(yǎng)前后大部分木質(zhì)素被降解的質(zhì)量以及少部分纖維素被降解的質(zhì)量，一般情況下為20%左右，15%到25%都屬于正常范圍。不計算質(zhì)量損失可得出糖化率，計算質(zhì)量損失可得出絕對糖化率，分別以處理前后的

90、樣品質(zhì)量為標準得到。因本次畢業(yè)設(shè)計時間有限所以還有很多后續(xù)試驗需要完善，因子的濃度也只設(shè)計了高低之分，后續(xù)可以在已篩選出的低濃度Mn2+離子和高濕度的基礎(chǔ)上，選擇較多的梯度。本次畢業(yè)設(shè)計只是發(fā)現(xiàn)了質(zhì)量損失的存在，尚不清晰質(zhì)量損失的是秸稈的具體哪種組分，后續(xù)可以對秸稈組分進行分析，以期能找到高降解木質(zhì)素和低降解纖維素的白腐菌預處理秸稈的最優(yōu)條件。</p><p><b>　　致 謝</b>&l

91、t;/p><p>　　時光荏苒，光陰如梭，回想起大一時初進實驗室時的青澀和無知，仿佛就在昨天。在近四年的時間里，我們不僅學會了很多實驗技巧和思想方法，而且學到了很多有關(guān)人生的哲理。</p><p>　　在這里，首先要感謝指導我們畢業(yè)設(shè)計的黃慧艷老師、余洪波老師，感謝他們辛勤的工作和對我們的悉心教誨，是黃老師給了我們走進華科實驗室的機會，也是她一直默默支持著我們所選擇的路。黃老師經(jīng)常在百忙之中抽

92、出時間和我們討論實驗的問題，尤其是這次做畢業(yè)設(shè)計時，當我們提出關(guān)于實驗進展出現(xiàn)的問題時，她在百忙之中一一解答了我們的困惑，不僅如此，還時常和我們交流實驗的設(shè)計，平時一直很關(guān)心實驗的進程，經(jīng)常抽出時間指導我們。</p><p>　　繼而要感謝的是陳慶同學和郭俊成同學，從我進實驗室時就是他們在指導我做實驗，他們不僅教會了我很多有關(guān)實驗的東西，而且平時還經(jīng)常和我談心，在我躊躇的時候給我很多建設(shè)性的意見。</p&g

93、t;<p>　　同時也要感謝實驗室馬老師，鄔老師及田老師，感謝實驗室里的其他師兄師姐們對我們實驗技能、實驗方案的悉心指導和熱情關(guān)懷，沒有他們的幫助，此次畢業(yè)設(shè)計也是無法完成的，故再次謹向他們表示我最誠摯的感謝！</p><p>　　當然，還要感謝我的父母，是父母的默默支持和鼓勵讓我一直走著自己喜歡的路，是父母的辛勤哺育和諄諄教導成就了我的今天。</p><p>　　最后，感謝

94、所有幫助過我的朋友們，我堅信，有了你們的支持，以后的路我將走得更好！</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 陳洪章.纖維素生物技術(shù).北京：化學工業(yè)出版社，2005.</p><p>　　[2] Betts WB, Dart RK, Ball AS, et al. Biosynthesis and struct

95、ure of lignocellulose. in: Betts WB (ed.). Biodegradation: Natural and Synthetic Materials. Berlin, Germany: Springer-Verlag, 1991. 139-155.</p><p>　　[3] 楊亞楠，陳亞松，楊敏.利用白腐菌生物預處理強化秸稈發(fā)酵產(chǎn)甲烷研究.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報2007，26（5）：

96、1968-1972.</p><p>　　[4] Daniel Cullen. Recent advances on the molecular genetic fungi. Jour-nal of Biotechnology, 1997, 53(2- 3): 273-289.</p><p>　　[5] Blanchette R A. Areviewofmicrobial deterio

97、ration found in archaeo-logical wood from different environments. International Biodeteriora-tion and Biodegradation, 2000, 46(3):189-214.</p><p>　　[6] 劉仁慶.纖維素化學基礎(chǔ).北京：科學出版社，1985.</p><p>　　[7] 高潔

98、，湯烈貴. 高分子科學叢書之纖維素科學.北京：科學出版社，1996.</p><p>　　[8] 李雄彪，張金忠.半纖維素的化學結(jié)構(gòu)和生理功能.植物學通報,1994，11（1）： 27-33.</p><p>　　[9] Hilden L, Johansson G. Recent developments on cellulases and carbohydratebinding modu

99、les with cellulose affinity. Letters in Biotechnology, 2004, 26 (2): 1683-1693.</p><p>　　[10] Tomme P, Gilkes N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi. Advances in Microbial Physiology, 1995, (3): 71-

100、81.</p><p>　　[11] Sun Y, Cheng JY. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, 2002, 83(1): 1–11.</p><p>　　[12] Wyman CE, Dale BE, Elander R

101、T, et al. Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresource Technology, 2005, 96(18): 1959-1966.</p><p>　　[13] Sun, Y. and J. Cheng, Hydrolysis of lignocellulosic materials fo

102、r ethanol production: a review. Bioresource Technology, 2002. 83(1): p. 1-11.</p><p>　　[14] Laureano-Perez, L, et al., Understanding factors that limit enzymatic hydrolysis of biomass. Applied Biochemistry a

103、nd Biotechnology, 2005. 124(1): p. 1081-1099.</p><p>　　[15] Sun R C, Sun X F. Effect of ultrasound on the structural and physiochemical properties of organosolv soluble hemicelluloses from wheat straw. Ultra

104、sonics Sonochemistry, 2002, 9: 95-101.</p><p>　　[16] Sheldon J, William D. Bioconversion of forest product of industry waste cellulosics</p><p>　　to fuel ethanol : A review. Bioresource Technolo

105、gy, 1996, 55(1): 1-33.</p><p>　　[17] Patrick J Collins, Jin A Field, Pauline Teunissen, et al. Stabilization oflignin peroxidases in white rot fungi by tryptophan. Applied and Environmental Microbiology, 199

106、7, 63(7): 2543-2548.</p><p>　　[18] Andre Ferraz, Jaime Rodriguez, Juanita Freer, et al. Biodegradation of Pinus radiata softwood by white- and brown- rot fungi. World Journal of Microbiology &Biotechnolo

107、gy, 2001, 17(1):31-40. </p><p>　　[19] 呂世翔, 王秋玉.白腐菌在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用進展.森林工程. 2009，25（4）：26.</p><p>　　[20] Leonowiez A, Matuszewska A, Luterek J, et al. Biodegradation of lignin by white rot fungi. Fun