枯草芽胞桿菌TR21誘導香蕉產(chǎn)生的抗病生理生化特性.pdf

1、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)TR21在大田通過葉腋噴施方式能夠有效防控香蕉枯萎病(Banana Fusarium Wilt)。為了深入研究枯草芽胞桿菌TR21噴葉防治香蕉枯萎病的作用機理，本論文對菌株在葉片的定殖以及定殖后引起的抗性生理變化和誘導的抗病相關基因表達展開了深入的研究。首先利用GFP標記技術研究了TR21在巴西蕉葉部的定殖規(guī)律;其次測定了TR21接種感抗香蕉品種（巴西蕉Musa spp.AAA cv.B

2、razil與農(nóng)科1號Musa spp.AAA cv.Nongke No.1）后引起的過氧化氫積累規(guī)律;然后測定了兩種基因型的感病品種（巴西蕉和廣粉1號蕉Musa spp.ABB cv.Guangfen No.1）經(jīng)TR21和尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Race4)菌株FOC009處理后根系中酚類化合物和木質(zhì)素含量的動態(tài)變化過程;最后利用實時熒光定量PCR技術分析了巴西

3、蕉CAT、POD、PAL、PAE、PR-1、PR-3六種抗病相關基因在單獨接種TR21、單獨接種FOC009和挑戰(zhàn)接種時的表達情況。結(jié)果如下:
　　 1.采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pHT315-gfp成功導入枯草芽胞桿菌TR21菌株，獲得的工程菌株TR21-gfp能穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白。利用熒光顯微鏡觀察TR21-gfp菌株在巴西蕉葉部的定殖過程，發(fā)現(xiàn)TR21噴葉片3h即在表皮細胞間隙大量匯聚，5h通過表皮的細胞間隙進入皮層細胞，

4、7h進入到葉肉細胞。接種6d后，表皮上已經(jīng)很少能夠觀察到細菌，但是在葉柄的細胞中檢測到細菌的存在。表明TR21能在香蕉葉片和葉柄定殖。
　　 2.利用DAB組織染色與H2O2含量定量測定方法，從定性和定量角度檢測了TR21根系接種巴西蕉與農(nóng)科1號蕉所引起的葉片H2O2動態(tài)變化。結(jié)果表明，以殼聚糖處理為陽性對照，TR21接種感病品種巴西蕉和抗病品種農(nóng)科1號根系都能引起葉片活性氧迸發(fā)，處理后12 h H2O2含量達到峰值，而殼聚糖處

5、理的峰值在8h，且H2O2含量隨TR21處理濃度的升高而升高，在TR21處理濃度為108cfu.mL-1，抗病品種農(nóng)科1號葉片H2O2含量顯著高于巴西蕉。
　　 3.以香蕉枯萎病菌4號生理小種FOC009菌株處理的根系為陽性對照，以清水處理為陰性對照，比較不同處理的廣粉1號和巴西蕉根系可溶性酚酸、細胞壁結(jié)合酚酸和木質(zhì)素累積和差異。結(jié)果顯示:處理后0h、12h、24 h、36h、48 h、60 h和72 h，不同處理根系可溶性酚酸

6、、細胞壁結(jié)合酚酸和木質(zhì)素含量隨時間延長逐漸增加，從48 h開始，病原菌處理和生防菌處理的可溶性酚酸、細胞壁結(jié)合酚酸和木質(zhì)素含量顯著高于清水處理;72h時，除廣粉根系可溶性酚酸外，病原菌處理的可溶性酚酸、細胞壁結(jié)合酚酸和木質(zhì)素含量顯著高于TR21處理。結(jié)果表明TR21葉腋接種能夠誘導感病品種香蕉根系酚類物質(zhì)和木質(zhì)素累積，與病原菌接種誘導的抗性反應表現(xiàn)類似，但低于病原菌誘導的水平。
　　 4、采用雙標準曲線法，以香蕉Actin基因作

7、為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR技術研究了噴葉接種菌株TR21、根系接種病原菌FOC009以及先噴葉接種TR213 d后再根系挑戰(zhàn)接種病原菌FOC009對巴西蕉根系6種抗病相關基因表達的影響。結(jié)果表明，相對清水對照，TR21處理能快速誘導CAT和POD基因的上調(diào)，在處理后的12h就與對照有顯著差異，但是不能誘導PAE基因的表達。TR21單獨接種48 h后也能引起PAL、 PR-1和PR-3基因的表達上調(diào)。挑戰(zhàn)組和病原菌FOC009處理組都