（節(jié)選）2014年--遺傳學外文翻譯--一種對大量病人的循環(huán)腫瘤dna超靈敏定量檢測方法（譯文）

1、<p><b>　　中文5250字</b></p><p>　　出處：Newman A M, Bratman S V, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J]. Nature Medicine, 2014,2

2、0(5):548-554.</p><p>　　一種對大量病人的循環(huán)腫瘤DNA超靈敏定量檢測方法</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是一種在非侵入性腫瘤負擔評估中極具前景的分子標記，然而現(xiàn)如今的ctDNA檢測技術在敏感度或病人覆蓋率以及臨床應用前景中存在不足。在此我們推出一種經(jīng)濟而高敏感度

3、的定量ctDNA的技術——CAPP-Seq（腫瘤個性化深度測序檔案）。我們在非小細胞肺癌（NSCLC）患者中實施了涵蓋95%腫瘤中確定突變的體細胞改變的多類別CAPP-Seq。我們發(fā)現(xiàn)在100%的II-IV期以及50%的Ⅰ期NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)ctDNA，并且96%的等位基因突變存在特異性低至0.02%的片段。ctDNA的水平與腫瘤體積，微小殘留病灶以及治療相關影像學改變之間存在高度相關性，因此ctDNA水平的測量比影像學能讓我們更早的

4、做出評估與對策。最后，我們通過CAPP-seq評估免活檢腫瘤篩查和基因分型。我們設想，應用CAPP-sep以檢測和監(jiān)測不同的惡性腫瘤可以作為常規(guī)臨床檢測，從而促進個性化癌癥治療</p><p>　　對ctDNA的分析有顛覆當前對腫瘤的發(fā)現(xiàn)與監(jiān)測的可能性。這種非侵入性獲取腫瘤來源DNA的方法在那些無法通過非侵入性手段對此取樣的實體腫瘤中非常受歡迎。在非小細胞肺癌中，已有基于PCR技術的序列以用于發(fā)現(xiàn)血漿DNA基因中

5、的復發(fā)變異點例如KRAS（鼠類肉瘤病毒癌基因）或EGFR（表皮生長因子受體），然而大部分病人并沒有在這些位點的變異情況。近來也有使用大規(guī)模平行測序來探測ctDNA的技術。然而這些報道的數(shù)據(jù)都體現(xiàn)了這些測序方法在敏感性上的不足，僅適用于一個較小的病人群體，對病人都需要額外的最佳算法以及額外的開銷。為了克服以上不足，我們設計了一種新的統(tǒng)計分析ctDNA的策略。我們的策略，CAPP-Seq，將優(yōu)化大眾低水平DNA基因庫與多相生物信息學技術結合

6、，設計了一個由生物素化的DNA寡核苷酸構成的， 針對我們關注的腫瘤的循環(huán)變異區(qū)域的“篩選器”。為了監(jiān)測ctDNA，選擇器用于腫瘤基因鑒定，以確定病人的腫瘤特異性基因偏差，然后直接在ctDNA中進行定量。在這里，我們展示其技術性能并探索CAPP-seq在早期和晚期NSCLC患者的效用。</p><p><b>　　結果</b></p><p>　　為NSCLC所設計的C

7、APP-Seq篩選器</p><p>　　在CAPP-seq實施初期，盡管我們的方法是適用于任何存在已被確定的復發(fā)突變的癌癥，我們著重關注NSCLC。為了設計一個非小細胞肺癌的篩選器，我們開始從COSMIC數(shù)據(jù)庫以及其他資源中列入那些可能驅動復發(fā)突變的基因的外顯子。之后，利用TCGA中所收錄的407位NSCLC患者的全基因組測序數(shù)據(jù)，我們應用一種迭代算法以最大化每個病人的錯義突變數(shù)量而同時最小化篩選器的大小<

8、;/p><p>　　大約8%的NSCLC受體變異涉及受體酪氨酸激酶基因編碼ALK（間變性淋巴瘤受體酪氨酸激酶基因），ROS1基因（酪氨酸激酶1）或RET原癌基因17-21。為了利用在內外顯子固有的連接變異中特有的序列的低錯義率，我們涉及了內含子和外顯子基因生成中的這些的反復融合斷點以完成最后設計。為了檢測腫瘤組織和血漿DNA中的基因融合。我們開發(fā)了一個為了優(yōu)化的超深覆蓋率數(shù)據(jù)的斷點測序算法，該算法的所應用的下一代測序

9、法（NGS）通過兩個非小細胞肺癌的數(shù)據(jù)從核苷酸層面將已知的細胞受體基因融合與以前所識別到的未知斷點。</p><p>　　總的來說，非小細胞肺癌的篩選器的設計覆蓋521個外顯子和13個內含子139復發(fā)性突變基因，總覆蓋約125 KB。這個小目標區(qū)間中（人類基因組的0.004%），篩選器能得到單核苷酸變異（SNV）的中位數(shù)為四，并覆蓋96%例肺腺癌或鱗狀細胞癌。為了驗證每個腫瘤的基因突變的數(shù)目，我們研究了從一個獨立

10、的隊列183例肺腺癌的WES數(shù)據(jù)的選擇區(qū)域。我們的篩選器覆蓋了以4個SNV為中位數(shù)的88%的病例，比從隨機抽樣的外顯子組所預期的要多4倍，從而驗證我們篩選器所設計的算法。</p><p><b>　　方法優(yōu)化與績效評價</b></p><p>　　我們通過NSCLC選擇器進行深度測序并實現(xiàn)約 10000×覆蓋（去除兩分法）基于測序深度中位數(shù)以及ctDNA檢測

11、限的考慮。我們共應用90個樣本，包括兩組非小細胞肺癌細胞株，17份原發(fā)腫瘤樣本與其對應外周血白細胞（PBL）以及18人的40血漿樣品，其中包括5為健康13位NSCLC患者。為了評估和優(yōu)化篩選性能，我們首先將它應用于從健康對照血漿中純化ctDNA，觀察其有效的捕獲到一致的基因組的DNA。血漿DNA片段測序得平均長度約170 bp ，與包含在染色體DNA的長度對應。通過優(yōu)化小批量的血漿DNA，我們將回收效率提高了300% 并構建了低至4納克

12、DNA的偏倚數(shù)據(jù)庫。</p><p>　　影響CAPP-Seq的檢測限和精度的因素有(i)循環(huán)DNA分子的回收率和輸入數(shù)量(ii)樣品交叉污染(iii)捕獲試劑和等位基因存在的潛在偏差(iv) PCR或測序錯誤。我們依次檢查了這些因素的每一個。首先，通過比較每一個樣本的輸入分子量與庫的復雜性的估計，我們計算出循ctDNA分子≥回收率49%。這與PCR產(chǎn)量之后計算出分子量一致。其次，通過分析病人的特定基因單核苷酸多

13、態(tài)性（SNP）的樣本，我們發(fā)現(xiàn)0.06%的多倍血漿DNA存在交叉污染，促使我們可以通過進一步分析可以將另一個病人檔案中的SNP種系從腫瘤衍生的SNV排除。接下來，我們評估病人外周血白細胞（PBL）樣本中雜合SNP種系中的等位基因偏移，并觀察捕捉到參考等位基因變異的最小偏倚。最后，我們分析了40種血漿DNA樣本在非參考等位基因中的分布，包括腫瘤衍生的SNVs和SNP種系。我們發(fā)現(xiàn)，0.006%的平均值和0.0003%中位數(shù)的背景，分別為（

14、圖2D），均大大低于先前報道的NGS 中分析ctDNA方法。</p><p>　　非種系ctDNA也可能在沒有腫瘤的情況下出現(xiàn)，這歸因于不同組織癌前細胞的貢獻，諸如此類的”生物背景“也有可能影響CAPP-Seq的敏感性。我們推測，生物背景，如果存在的話，會升高頻發(fā)突變位置已知的癌癥驅動基因的突變率，因此在所有40個樣品中25個發(fā)現(xiàn)107個癌癥相關的SNV，且不包括在每個病人的腫瘤發(fā)現(xiàn)的體細胞突變。雖然中位數(shù)的分數(shù)

15、豐富與全球選擇背景是可比較的（約0%），平均值略高，約0.01%。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)了一個突變熱點（抑癌TP53，r175h）在血漿中的DNA樣本的頻率約為0.18%，包括患者和健康對照組。當我們觀察這TP53突變等位基因的頻率要明顯高于全球背景（P＜0.01），我們推測，它反映了真實的生物克隆異質性，從而排除了它作為一個潛在的報道位點的可能。為了更一般地處理背景，我們將背景率等位基因特異性差異標準化，以評估ctDNA檢測的意義。結

16、果是，我們發(fā)現(xiàn)，生物背景的檢測限略高于0.01% ，不是影響ctDNA定量的主要因素。</p><p>　　接下來，我們嘗試性檢測CAPP-Seq的檢測限以及線性。我們準確地檢測輸入的高線性度的分數(shù)豐度在0.025%和10%之間的的非小細胞肺癌DNA，我們觀察到在四個SNP報道的臨界值僅有邊緣的誤差度量改善，這相當于每個腫瘤的選擇器確定SNV的中位數(shù)。此外，融合斷點的豐度分數(shù)，插入和缺失（indel）和拷貝數(shù)變化

17、（CNAS）與預期濃度高度相關。</p><p>　　體細胞突變檢測與腫瘤負荷定量</p><p>　　我們接下來將CAPP-seq應用于在17例NSCLC腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)體細胞突變，樣本包括福爾馬林固定的手術切除，穿刺活檢標本及惡性胸腔積液。在腫瘤和其對應的樣品系中實施大約5000×平均測序深度（去除兩分法），我們發(fā)現(xiàn)了100%個先前確定的SNVs和基因融合和發(fā)現(xiàn)了許多額外的體細

18、胞變異。此外，我們在堿基層次中發(fā)現(xiàn)了特定斷點并發(fā)現(xiàn)這八個特定基因融合的伴侶基因涉及ALK和ROS1。腫瘤所含變異幾乎預計一樣，從不吸煙者含有的SNV比那些人的基因融合較少。</p><p>　　排除患者基因融合，我們發(fā)現(xiàn)每名患者有平均六個SNVs（三錯義）（表1），與我們的篩選器設計一致。</p><p>　　我們評估了SAPP-seq疾病監(jiān)測和微小殘留病的檢測中的敏感性和特異性，我們使用

19、從5名健康對照者以及13位非小細胞肺癌患者所收集的35例血漿樣本。我們綜合在多個實例和體細胞突變的信息作為ctDNA的檢測指標。該指數(shù)是類似于一個和基于以突變斷點為優(yōu)先的決策樹的假陽性率，由于其所存在的背景的P值從多個類型報道集成。當我們將這種方法應用在接受器操作特征（ROC）分析，CAPP-seq曲線下的面積（AUC，濃度-時間曲線下面積）為0.95，對于所有血漿DNA標本具有最大的靈敏度和特異性，未經(jīng)治療的患者85%，健康對照組為9

20、6%。Ⅰ期腫瘤患者的敏感性為50%，其中Ⅱ-IV期腫瘤的敏感性為100%，兩組的特異性為96%。此外，CAPP-Seq表現(xiàn)出強大的同時分析前、后樣品性能，AUC值在所有階段為0.89，在II–IV階段0.91。此外，通過調節(jié)ctDNA檢測指標，我們可以增加特異性高達98%同時還捕捉三分之二的所有癌癥陽性樣本及四分之三的II期–IV期癌陽性標本。因此，CAPP-seq可以實現(xiàn)腫瘤負擔強大的評估以及根據(jù)樣本可變的的敏感性和特異性。</

21、p><p>　　血漿樣品中NSCLC腫瘤負荷定量</p><p>　　我們不禁發(fā)問，是否與放射學測量腫瘤體積和臨床治療療效與可檢測到的ctDNA水平相關。</p><p>　　根據(jù)SNV或報道，血漿中的碎片ctDNA水平從0.02% 到 3.2%不等，在未治療樣本中中位數(shù)約為0.1%。在未治療樣本中絕對的ctDNA水平顯著的與計算機斷層掃描檢測（CT）以及正電子成像術（

22、PET）中的腫瘤體積相關。</p><p>　　要確定是否ctDNA濃度縱向反映樣本的疾病負擔，我們分析了三例不同的治療方案晚期非小細胞肺癌患者的血漿DNA。在未治療樣品中，在治療過程中ctDNA水平和腫瘤體積高度相關，無論所檢測到的變異類型是一系列SNV，得失位變異，多基因融合或基因融合與SNV并存。</p><p>　　值得注意的是，在一個病人中，我們確定了一個經(jīng)典的EML4-ALK基

23、因融合，以及先前未涉及的兩個ROS1基因融合：fyn-ros1和ros1-mkx。所有的融合由基因組DNA擴增定量PCR（qPCR）證實并在血漿樣品中分別重建。據(jù)我們所知，這是第一次在同一非小細胞肺癌患者觀察ROS1和ALK的基因融合。我們設計的非小細胞肺癌的CAPP-seq選擇器在每個腫瘤中檢測多個SNV。</p><p>　　在另一個病人中，這樣的篩選器使我們能夠識別與活化的EGFR突變的優(yōu)勢克隆以及一個導致

24、厄洛替尼耐藥的“門衛(wèi)”EGFR T790M克隆突變。血漿DNA中這些克隆的比率與腫瘤活檢中的完全一致，這表明我們的方法有用于檢測和量化潛在的臨床相關的亞克隆的潛力。</p><p>　　II、III期非小細胞肺癌患者常有放療及監(jiān)控CT或PET-CT掃描的輻射在肺和周圍組織引起炎癥和纖維化改變因而難以到達病灶。一個IIB期非小細胞肺癌的患者在經(jīng)過放射治療后，隨訪成像顯示存在一個代表疾病殘留的大腫塊。然而，與此同時檢

25、測不到ctDNA（表示無疾病殘留），患者無病生存22個月后，說明ctDNA的結果為真。另一個病人是IIIB期非小細胞肺癌，接受放化療治療，隨訪成像顯示接近完全治愈，然而，的ctDNA濃度略有增加，表示存在隱匿性微小病變進展，事實上，7個月后進展到臨床檢測程度，病人最終死于肺癌。這些數(shù)據(jù)說明ctDNA在鑒別患者在經(jīng)過治療后是否存在復發(fā)病灶非常有效。</p><p>　　我們試問低CAPP-seq檢測限是否能允許我們

26、更早的檢測到更早期的NSCLC呢？這里舉兩位病人為例子。一位接受了手術，立體定向放療（SABR）27的患者，確診是IB期NSCLC。我們在其治療前血漿樣品中檢測到ctDNA，然而在術后的3-32個月并未檢測到ctDNA，這表明該病人并未患病或已治愈。另一位初始PET-CT監(jiān)測掃描以及之后的SABR顯示腫瘤存在剩余量，該影像學結果解釋為代表殘余腫瘤或放療后炎癥。我們通過檢測ctDNA沒有發(fā)現(xiàn)任何疾病殘留的證據(jù)，而病人在治療后21個月隨訪內

27、仍然無病，這與之后病人無病的假說相符?？傊@些結果表明CAPP-seq存在測量早期和晚期非小細胞肺癌，在不同類型的治療ctDNA監(jiān)測腫瘤的負擔的潛能。</p><p>　　無組織活檢和腫瘤基因分型</p><p>　　最后，我們探討了CAPP-seq是否有DNA序列系統(tǒng)分析并用于癌癥篩查和活檢游離腫瘤基因分型的潛能。作為基本證明，我們使自己不知道每個病人的腫瘤的基因突變，并應用了一個新的

28、統(tǒng)計方法，以測試在每個血漿樣品在我們的隊列中存在的癌癥基因。通過實施我們的高特異性癌癥篩查方法，我們正確地通過豐度分數(shù)為0.4%的ctDNA成功將100%的病人血漿樣本分類，假陽性率為0%。因此CAPP-Seq有提高對高危進展NSCLC患者中，低劑量CT篩查的低陽性預測值。</p><p>　　此外，當我們考察CAPP-seq無創(chuàng)性檢測EGFR和KRAS突變的能力時，我們100%正確得檢測到了特異性大于99%的，

29、等位分數(shù)大于0.1%的變異。CAPP-seq可能因此使免活檢游離腫瘤活檢基因型患者的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌的效用最大化。然而，檢測與確定Ⅰ期腫瘤基因型的技術方面，還要方法上的改進。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　在這項研究中，我們提出了為ctDNA定量新方法，CAPP-seq。其主要特點包括高靈敏度和特異性，卻沒有對所有非小細胞肺

30、癌患者具體優(yōu)化和覆蓋范圍的需要。據(jù)我們所知，CAPP-seq是第一個以NGS為基礎的分析ctDNA的方法，在一個合理的成本內達到超低檢測限和廣大患者的覆蓋范圍。我們的方法，通過整合多個病例以及多系列突變的信息內容，降低了潛在的隨機背景和生物變異對腫瘤負擔定量的影響（例如，突變或檢測限附近的亞進化）。這些特點使微小殘留病和I期非小細胞肺癌腫瘤DNA定量檢測更加便利。雖然我們專注于非小細胞肺癌，我們的方法可以對于任何惡性腫瘤的復發(fā)突變數(shù)據(jù)都

31、是可用的。</p><p>　　在許多患者中，DNA水平大大低于先前描述的基于測序的結論的檢測閾值。例如，在大多數(shù)肺癌和結直腸癌中治療前ctDNA濃度＜0.5%，治療后，ctDNA的濃度通常下降，因而需要更低的檢測閾值。此前公布的ctDNA檢測方法采用擴增子，全外顯子，或全基因組測序，即使在十倍或更大的測序成本下，在檢測多數(shù)非小細胞肺癌患者ctDNA中不夠敏感。</p><p>　　為了進

32、一步擴大ctDNA定量在臨床應用的潛力，在檢測閾值的額外收益是可取的。潛在的方法包括使用DNA條形碼技術以抑制PCR文庫制備中產(chǎn)生的錯誤，增加用于ctDNA分析的量以超過在我們的研究中使用的平均血漿量1.5毫升等策略。</p><p>　　CAPP-Seq 的第二限制是其捕獲基因融合上的不足，這有可能低估腫瘤負擔。然而，當這些偏倚類型在其他報道中出現(xiàn)過之后是可以分析解決的。最后，盡管我們發(fā)現(xiàn)CAPP-seq可以定

33、量CNAs（血漿循環(huán)核苷酸），我們當前篩選器的設計沒有優(yōu)先考慮這些類型的誤差，我們預計，加入一定的對CNAS的覆蓋將被證明在監(jiān)測不同類型的癌癥中是有用的。綜上所述，對血漿DNA的雜交捕獲和高通量測序使大部分NSCLC患者的ctDNA非侵入性高敏感檢測成本降低。CAPP-Seq因此有應用于常規(guī)臨床，促進個性化檢測，治療以及監(jiān)控的潛力。我們預計，CAPP-seq將在各種臨床環(huán)境被證明是有價值的，包括在生物流體和標本與低癌癥細胞樣本的癌細胞D