絨山羊絨毛周期相關microRNA及其靶基因的研究.pdf

1、內蒙古絨山羊是自治區(qū)地方優(yōu)質資源品種，絨毛生產性能是內蒙古絨山羊的重要經(jīng)濟性狀。影響絨毛生長的因素有很多，而褪黑激素、miRNA是其中兩個非常重要的因素。近年來，關于褪黑激素影響絨山羊絨毛生長的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)埋植褪黑素可促進羊絨提前進入生長期，誘發(fā)2次生絨并在分子水平改變了很多絨毛生長相關基因的表達，而對于miRNA這一重要毛發(fā)生長調控因子的研究未見詳細報道。因此，本研究以miRNA為介導，通過microRNA靶基因指紋圖譜、實時熒光定

2、量PCR、RNA-seq等試驗手段，建立外源褪黑激素、miRNA及其靶基因的關系，進一步從分子水平上的解析褪黑激素促進絨毛生長的機理，為提高絨毛產量和品質提供理論依據(jù)。
　　主要研究結果如下:
　　1、microRNA靶基因指紋圖譜(MTFP)方法的建立
　　建立了一種實驗性獲得miRNA靶基因的新方法(microRNA Targets FingerPrint，MTFP)。該方法在設定上游種子序列的互補序列和下游錨定序

3、列的基礎上添加特殊接頭，通過反轉錄和特殊二步PCR將microRNA的靶基因擴增;擴增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測其片段大小和表達豐度，用于篩選在不同生理狀態(tài)或試驗條件下特異表達的基因;特定的靶基因序列通過DNA回收和測序方法得到。以miR-203為例，在不同生理狀態(tài)的山羊皮膚樣品中獲得了5條大小分別為718 bp(JN709494)、349bp(JN709495)、243bp(JN709496)、156bp(J

4、N709497)和97bp(JN709498)的靶基因序列。其中JN709494，JN709497，JN709498分別為MBNL1、ZKSCAN1、SLC7A60S的同源基因。MTFP經(jīng)濟適用、可操作性強，可用于探索microRNA調節(jié)的靶基因，或用來評估靶基因的表達譜特征。
　　2、褪黑激素影響miRNA及其靶基因的研究
　　埋植褪黑激素明顯改變了6個絨毛相關miRNA的表達規(guī)律。一個絨毛周期內，除let-7外，miRN

5、A的表達量發(fā)生三次躍遷。對照組中miR-203、miR-205、let-7、miR-96、miR-183均是8、9月份以較低水平基本保持不變，10月開始上升，11月達到全年的最高水平后急劇下降，并于2月、6月又出現(xiàn)兩個小的表達高峰; miR-205表達規(guī)律與其余5個miRNA基本一致，一個絨毛周期內也出現(xiàn)3個表達高峰，全年表達量最高值出現(xiàn)在12月。埋植組中miR-203、miR-205出現(xiàn)3個明顯的表達高峰，分別是10月、12月、2月，

6、miR-203全年表達最高值出現(xiàn)在10月，miR-205則位于2月;miR-96、miR-199a全年內在10月、12月、2月雖然也出現(xiàn)了三個峰值，但除了10月達到全年最高水平外，其余兩個峰值波動不明顯;miR-183埋植褪黑激素后全年處于較低水平。
　　埋植褪黑激素改變了miRNA之間的共表達模式。對照組各miRNA之間相關系數(shù)范圍為0.87-0.99，均大于0.85，與對照組相比，埋植組中l(wèi)et-7a與miR-96、miR-1

7、99a、miR-205,miR-203與miR-96、miR-199a, miR-96與miR-183,miR-183與miR-199a之間的相似性被明顯消弱。
　　MTFP并未檢測到埋植前后特異條帶的分布，但定性的分析了候選miRNA的靶基因。
　　3、埋植組與對照組10月皮膚組織轉錄組文庫構建及測序分析
　　在構建內蒙古絨山羊10月皮膚埋植組與對照組轉錄組文庫的基礎上進行了illumina高通量測序，共獲得8千多萬

8、條100bp的reads，從頭組裝得到了60，565條contigs，contigs的平均長度為656bp，N50為860bp，最長的contigs為19，346bp。大于300bp的contigs52，331條。通過CLCgenomicWorkbench6.0的RNAseq分析篩選到fold_change(MT-10/C-10)＞4、Q-value＜0.001或fold_change(MT-10/C-10）＜-4、Q-value＜0.

9、001的差異contigs465條，其中393條contigs序列顯著上調，72條contigs序列顯著下調，420條contigs在NR數(shù)據(jù)庫具有注釋信息。對這些差異基因進行GO分類和KEGG通路分析，上調基因富集到發(fā)育相關的16條通路，包括黏著斑連接、細胞外基質-受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架調控、TGF-β信號通路、Wnt信號通路等16個pathways。下調基因未發(fā)現(xiàn)顯著性富集通路。
　　4、褪黑激素介導miRNA候選靶基

10、因的研究2@為了進一步研究褪黑激素、miRNA及其靶基因的關系。本研究首先基于10月轉錄組contigs數(shù)據(jù)，利用miranda3.0軟件預測得到7個miRNA介導調控16750條contigs序列。通過埋植組與對照組RPKM值比較篩選到Q value＜0.05且|Fold_change|≥2的contigs912條。結合本研究實驗獲得的miRNA靶基因數(shù)據(jù)，確定miR-203及靶基因DOST，let-7a及靶基因LYPLA1、ND4，