鴨甲肝病毒1型一個(gè)保守的中和性線性B細(xì)胞表位的確定.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duckviralhepatitis)是由鴨甲肝病毒(DuckhepatitisAvirus，DHAV)和鴨星狀病毒(Duckastrovirus)引起的雛鴨的一種高度致死、傳播迅速的病毒性疾病，主要感染1～3周齡雛鴨，死亡率高達(dá)90％以上。其中DHAV型鴨肝炎呈世界范圍分布，是對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)威脅最大的一種傳染病。但是有關(guān)DHAV病毒蛋白功能的研究較少。本研究是在已經(jīng)研制了DHAV-1單克隆抗體的基礎(chǔ)上，通過對(duì)毒株LY0801的

2、結(jié)構(gòu)蛋白VP1及其分段的基因克隆，表達(dá)，免疫活性的檢測(cè)，對(duì)具有病毒中和作用的DHAV-1單克隆抗體4F8所識(shí)別的抗原表位進(jìn)行準(zhǔn)確定位，為DHAV-1的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查、新型表位疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。本研究主要包括以下內(nèi)容：
　　 1、5株DHAV-1特異性單克隆抗體識(shí)別抗原表位的初步分析
　　 本研究通過腹腔注射小白鼠的方法制備了針對(duì)5株具有中和性能的DHAV-1的特異性單克隆抗體。以DHAV-1LY0801株的

3、cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增DHAV-1完整的VP1基因，將其克隆入桿狀病毒表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞后，通過IFA確定實(shí)驗(yàn)室制備的5株單克隆抗體識(shí)別的抗原表位均位于DHAV-1的VP1蛋白上；Westernblot試驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)慰?F8和5G4識(shí)別的是線性表位，而單抗1E10、4E6和5E11識(shí)別的是構(gòu)象性表位。
　　 2、單克隆抗體4F8識(shí)別線性表位的準(zhǔn)確定位研究
　　 本研究采用交叉重疊法設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了1

4、3段VP1分段蛋白的pEF-32a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Rosetta菌株中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳確定表達(dá)后，用單克隆抗體4F8分別進(jìn)行Westernblot分析，根據(jù)Westernblot結(jié)果結(jié)合引物設(shè)計(jì)推測(cè)4F8識(shí)別的抗原表位；構(gòu)建表達(dá)DHAV-1不同長(zhǎng)度VP1蛋白的桿粒，轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞后對(duì)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使用單克隆抗體4F8對(duì)轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)。根據(jù)Westernb