在hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中Nrf2對(duì)ATF4蛋白表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis，ALS)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中最常見(jiàn)的類型，該病的特點(diǎn)是上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累表現(xiàn)為痙攣、構(gòu)音障礙和吞咽困難等;下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌束顫動(dòng)等。大約90％的肌萎縮側(cè)索硬化病例為散發(fā)性(sporadicALS，sALS)，10％為家族性肌萎縮側(cè)索硬化(familialALS，fALS)。1/5的fALS病例與突變的銅鋅超氧化物歧化酶Ⅰ型(Cu

2、/Znsuperoxidedismutase1，SOD1)有關(guān)。其中以突變的G93A位點(diǎn)最常見(jiàn)，即基因密碼子第93位點(diǎn)上的丙氨酸被甘氨酸替代。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，與人類運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病相似，是國(guó)際上公認(rèn)研究ALS的動(dòng)物模型。
　　用轉(zhuǎn)染了人類突變的SOD1(humanmutantSOD1，hmSOD1)的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)hmSOD1通過(guò)很多途徑損害運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，例如:氧化應(yīng)激反應(yīng)、錯(cuò)誤

3、折疊/未折疊蛋白聚集、線粒體功能受損、谷氨酸興奮毒性等。近年來(lái)許多學(xué)者提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激學(xué)說(shuō)。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個(gè)多功能細(xì)胞器，它是蛋白質(zhì)的合成、加工處理和折疊的場(chǎng)所，也是鈣離子的儲(chǔ)存庫(kù)。當(dāng)鈣離子平衡紊亂或錯(cuò)誤折疊/未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚時(shí)就可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緊接著觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)來(lái)輔助蛋白質(zhì)折疊以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以起到細(xì)胞保護(hù)功能，但細(xì)胞中發(fā)生過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可以引起細(xì)胞功能障礙，甚至細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表

4、面存在三種跨膜蛋白，分別為PERK(PKR-likeERkinase)、ATF6(activatingtranscriptionfactor6)和IRE1(inositol-requiringenzyme1)。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，這幾種蛋白分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶GRP78分離而被激活，激活的蛋白分別介導(dǎo)三條通路。
　　PERK通路是三條通路中最早被激活的，PERK與GRP78分離后通過(guò)自身的二聚化和磷酸化而被激活，磷酸化的PERK（

5、pPERK）使eIF2α51位絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而使蛋白質(zhì)的合成減緩或者停止。磷酸化的eIF2α(peIF2α)激活A(yù)TF4，引起ERAD、GADD34、CHOP蛋白表達(dá)的增多，GADD34負(fù)反饋性的調(diào)節(jié)eIF2α的磷酸化。磷酸化的PERK在激活eIF2α的同時(shí)也使Nrf2（NuclearFactorErythroid2-RelatedFactor2）與Keap1分離并活化，活化的Nrf2由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并需要在ATF4的協(xié)同作

6、用下上調(diào)二相解毒酶的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　TarasAfonyushkin等人研究表明eIF2α上調(diào)ATF4的翻譯，而Nrf2上調(diào)ATF4mRAN的轉(zhuǎn)錄。Nrf2和ATF4相互結(jié)合后與一些二相解毒酶基因上的ARE序列結(jié)合，上調(diào)二相解毒酶的表達(dá)，以此調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與Nrf2-/-小鼠雜交制備敲除Nrf2的hmSOD1G93A小鼠，并以此為研究對(duì)象，使用免疫組織化學(xué)及激光共聚

7、焦方法研究不同時(shí)期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目及ATF4表達(dá)部位變化情況，通過(guò)免疫印跡方法研究ATF4在不同時(shí)期小鼠的變化情況及Nrf2對(duì)其表達(dá)的影響情況。
　　方法:
　　1、動(dòng)物模型的飼養(yǎng)及鑒定
　　所有小鼠均飼養(yǎng)在SPF（specificpathogenfree）環(huán)境中，即恒濕、恒溫(25-27℃)以及無(wú)特定病原菌的環(huán)境，以無(wú)菌水、及滅菌的SPF級(jí)顆粒鼠糧喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的過(guò)程遵守河北省實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理規(guī)定。實(shí)驗(yàn)所用小鼠均從美國(guó)J

8、ackson實(shí)驗(yàn)室(BarHarbor,ME，USA)買(mǎi)進(jìn)。將SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠與Nrf2-/-小鼠雜交，制備Nrf2敲除的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。采用剪取子代小鼠尾尖的方法獲取子代小鼠的DNA，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，鑒定是否帶有Nrf2及SOD1G93A基因。
　　2、免疫印跡
　　按照SnowRJ的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將實(shí)驗(yàn)小鼠分為癥狀前期組（0分，約出生后60天）、癥狀早期組（2分，約出生后90天）和終末期組（5分，約出

9、生后120天），每組均設(shè)立同窩同性別同年齡對(duì)照。新鮮獲取小鼠腰髓，保存于-80℃冰箱備用。采用抽提裂解法提取蛋白，通過(guò)westernbolt方法測(cè)定ATF4在Nrf2+/+G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時(shí)期的表達(dá)并在終末期小鼠中研究敲除Nrf2對(duì)ATF4表達(dá)的影響。
　　3、免疫組化
　　將Nrf2+/+G93A轉(zhuǎn)基因小鼠分為三組（癥狀前期、癥狀早期和終末期），每組均設(shè)立同窩同性別同年齡對(duì)照。用多聚甲醛固定小鼠的腰髓。振蕩切片后，保

10、存于4℃?zhèn)溆?。將小鼠腰髓進(jìn)行ATF4免疫組化染色。
　　4、激光共聚焦
　　腰髓標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定后，用振動(dòng)切片機(jī)切成25um厚的薄片，與免疫組化步驟相似，一抗孵育后，F(xiàn)ITC、Cy5分別標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠二抗。并加Hochest核熒光染色劑孵育后，抗衰減熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察抗體分布位置，探討Nrf2對(duì)ATF4表達(dá)部位的影響。
　　結(jié)果:免疫印跡方法觀察ATF4在轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠表

11、達(dá)量較少，且在60-120天之間隨年齡的增長(zhǎng)無(wú)明顯差異性。在Nrf2+/+G93A小鼠的腰髓中，ATF4的表達(dá)在癥狀前期就有所升高（P＞0.05），在癥狀早期明顯升高(P＜0.05），終末期有所下降（P＜0.05）。ATF4在Nrf2+/+G93A終末期小鼠的表達(dá)比在Nrf2-/-G93A終末期小鼠顯著升高(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示隨著疾病的進(jìn)展運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)逐漸減少，且組織出現(xiàn)空泡化，ATF4的表達(dá)在癥狀前期較對(duì)照組無(wú)明顯差