轉(zhuǎn)基因飼料中bar基因檢測方法的研究.pdf

1、從Streptomyces hygroscopicus(吸水鏈霉菌)中分離得到的bialaphos resistance gene（Bar基因）被證明具有良好的抗除草劑效果，用轉(zhuǎn)基因育種的方法將Bar基因?qū)氲阶魑镏信嘤丝钩輨┑霓D(zhuǎn)基因作物（如棉花、玉米等），隨著抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積的增加，且越來越多地應用到動物飼料中，Bar基因可能間接地隨著動物性產(chǎn)品進入人類食物鏈，由于轉(zhuǎn)Bar基因飼料的安全性問題目前仍不明確，急需對轉(zhuǎn)Bar

2、基因飼料進行檢測并標識，保護使用者對轉(zhuǎn)Bar基因飼料的知情權(quán)。本研究即以檢測飼料中是否含轉(zhuǎn)Bar基因為目的，分別從基因和蛋白水平建立快速便捷的檢測方法。
　　 1、檢測飼料中轉(zhuǎn)Bar基因?qū)崟r熒光定量PCR方法的研究。根據(jù)NCBI中已發(fā)表的Bar基因序列設計引物和探針，通過對試驗條件的優(yōu)化和對人工模擬混合飼料樣品的檢測，建立了能檢測轉(zhuǎn)Bar基因成分為0.5％的飼料樣品，說明本試驗建立的實時熒光定量PCR方法適用于對轉(zhuǎn)Bar基因飼料

3、的檢測。
　　 2、檢測飼料中轉(zhuǎn)Bar基因產(chǎn)物PAT蛋白的免疫膠體金層析試紙條方法的建立。Bar基因編碼的膦化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，能分解除草劑中的有效成分草丁膦(PPT)，起到抗除草劑的作用。用DNAStar生物學分析軟件對Bar基因編碼PAT蛋白的氨基酸序列進行分析，預測其潛在的抗原表位，并合成了六條潛在抗原表位多肽，通過免疫Balb/c小鼠獲得抗體，篩選出具有抗原表位的多肽，得到編碼抗原表位的基因片段。通過編碼柔性氨

4、基酸的DNA序列將基因片段連接，重組Bar基因，并加入BamHI、XhoI酶切位點。將重組Bar基因與原核表達載體pGEX-6P-1連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-CBG544。經(jīng)限制性酶切、PCR和測序驗證正確后，將重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-CBG544轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達，經(jīng)IPTG誘導，表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，蛋白相對分子量約為46kD，將包涵體離心、洗滌和親和層析純化，獲得了高純度重組蛋白pGEX-6P-1-PAT。

5、用重組的pGEX-6P-1-PAT蛋白免疫日本大耳白兔獲得的抗體，經(jīng)純化、鑒定，得到了純度較高的抗重組PAT蛋白的抗體。
　　 用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒并標記抗重組PAT蛋白的抗體，獲得金標抗體，將其包被在玻璃纖維上，并將抗體（檢測線）和羊抗兔IgG(質(zhì)控線)分別包被在硝酸纖維素膜上，按順序組裝膠體金快速檢測試紙條。以人工模擬混合飼料樣品作為檢測對象，并與檢測PAT蛋白的ELISA試劑盒進行比較。結(jié)果證實膠體金試紙條可檢出