高鹽-低溫脅迫下水稻葉細(xì)胞內(nèi)ASC的氧化還原狀態(tài)和外源ABA的作用研究.pdf

1、采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)、基因克隆、原核表達(dá)等分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法，研究了水稻葉內(nèi)ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)和氧化還原平衡及其介導(dǎo)下的活性氧清除系統(tǒng)對(duì)高鹽/低溫逆境的響應(yīng)。
　　 第一，水稻響應(yīng)高鹽/低溫脅迫的ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)和氧化還原網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。
　　 氧化還原網(wǎng)絡(luò)具有清除ROS的功能，由抗氧化的非酶類物質(zhì)如抗壞血酸(ASC)、谷胱甘肽、生育酚等和抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞

2、血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)等組成?；虮磉_(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)分析表明，該系統(tǒng)涉及191個(gè)基因和/或EST。在低溫逆境下，秈稻(i-93-11)/粳稻(j-NJ-1)表達(dá)上調(diào)（2倍以上，下同）基因有5/5個(gè)、下調(diào)（0.5倍以下，下同）基因有2/6個(gè);在高鹽脅迫下，表達(dá)上調(diào)基因32/27個(gè)、下調(diào)基因13/25個(gè)。
　　 ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)體系包括ABA合成、ABA分解途徑和紫黃質(zhì)循環(huán)。基因表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)分析表明，該系

3、統(tǒng)涉及22個(gè)基因和/或EST。在低溫逆境下，秈/粳稻表達(dá)上調(diào)基因3/2個(gè)，沒有檢測(cè)到表達(dá)下調(diào)基因;在高鹽脅迫下，秈/粳稻表達(dá)上調(diào)基因7/6個(gè)、下調(diào)基因6/5個(gè)。在高鹽/低溫脅迫下，NCED基因、8’OX基因、ZEP和VDE基因表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，這些基因的產(chǎn)物分別是ABA合成、ABA分解途徑和紫黃質(zhì)循環(huán)中的關(guān)鍵酶，說明ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)在逆境條件下也起著關(guān)鍵作用。
　　 進(jìn)一步根據(jù)水稻基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建了水稻響應(yīng)高鹽/低溫

4、脅迫的ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)和氧化還原平衡介導(dǎo)的ROS清除網(wǎng)絡(luò)，這是一個(gè)龐雜的酶促和非酶促生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)體系，涉及到光合電子傳遞、呼吸鏈電子傳遞。該體系在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體（基質(zhì)、類囊體膜、類囊體腔）和線粒體（內(nèi)膜和基質(zhì)）、過氧化物體等中進(jìn)行。水稻中至少包括191個(gè)和22個(gè)基因組成的網(wǎng)絡(luò)分別參與ROS的調(diào)控和ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)，該網(wǎng)絡(luò)具有高度的靈活性和互補(bǔ)性。抗壞血酸(ASC)的氧化還原作用將ROS清除系統(tǒng)和ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)有機(jī)地聯(lián)系在一起，形

5、成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在保護(hù)水稻光合機(jī)構(gòu)免受氧化傷害的過程中起著非常重要的作用。
　　 第二，高鹽或低溫脅迫下ABA-紫黃質(zhì)循環(huán)體系的保護(hù)作用。
　　 ABA預(yù)處理(+ABA)和非ABA預(yù)處理(-ABA)水稻葉片分別進(jìn)行高鹽脅迫(+SS)和非高鹽脅迫（-SS）、低溫處理(+LT)和非低溫處理（-LT）后，置入1500μmolm-2s-1的PFD下，測(cè)定不同處理水稻葉片的PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（(φ)PSⅡ）、非光化學(xué)淬滅(

6、NPQ)、紫黃質(zhì)循環(huán)組分，并對(duì)紫黃質(zhì)(V)的脫環(huán)氧化作用進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。采用RTqPCR技術(shù)，研究了ABA代謝和紫黃質(zhì)循環(huán)相關(guān)基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。根據(jù)水稻基因組序列和已知的ABA代謝和紫黃質(zhì)循環(huán)相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)克隆到相關(guān)基因翻譯起始位點(diǎn)ATG上游啟動(dòng)子序列，克隆了三個(gè)關(guān)鍵酶(ZEP、NCED和VDE)基因，并進(jìn)行了分子生物學(xué)分析。
　　 高鹽脅迫或低溫逆境下PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)下降、

7、PSⅡ還原性增強(qiáng)、非光化學(xué)淬滅(NPQ)增加。與低溫逆境相比，高鹽脅迫導(dǎo)致PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)下降得更多，PSⅡ更還原，非光化學(xué)淬滅(NPQ)上升的幅度更少。外源ABA可減少PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)下降，減輕PSⅡ的還原狀態(tài)，并增加非光化學(xué)淬滅(NPQ)容量。因此，低溫逆境水稻較高鹽脅迫水稻，ABA預(yù)處理水稻較非ABA預(yù)處理水稻有更高的光合電子傳遞活性(P)，更多的能量耗散(D)和更少的過量光能(E)積累。外源ABA

8、可增大水稻葉片中紫黃質(zhì)循環(huán)庫，促進(jìn)紫黃質(zhì)循環(huán)組分中紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化作用，通過改變紫黃質(zhì)循環(huán)動(dòng)力學(xué)提高非光化學(xué)淬滅(NPQ)水平。外源ABA和紫黃質(zhì)循環(huán)介導(dǎo)的非光化學(xué)淬滅(NPQ)之間的協(xié)同作用可保護(hù)水稻葉片在高鹽脅迫/低溫逆境下免受氧化傷害。
　　 高鹽脅迫(-ABA+SS)下NCED4基因，低溫逆境（-ABA+LT）下NCED5和NCED4基因表達(dá)上調(diào)，分別為7.579、3.777和3.589倍。另外，高鹽脅迫/低溫逆境下8'O

9、X1基因的表達(dá)量分別高達(dá)13.874和51.253倍，VDE基因的表達(dá)量分別達(dá)2.326和2.956倍，ZEP基因的表達(dá)量分別達(dá)2.985和1.874倍。NCED、8'OX、VDE和ZEP酶分別是ABA合成、ABA分解和紫黃質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵酶，高鹽脅迫/低溫逆境能誘導(dǎo)ABA的代謝和紫黃質(zhì)循環(huán)。外源ABA能明顯增加+ABA+SS、+ABA+LT水稻葉內(nèi)上述基因的表達(dá)量。
　　 在高鹽脅迫(-ABA+SS)、低溫逆境(-ABA+LT)、

10、或在添加外源ABA的高鹽/低溫(+ABA+SS和+ABA+LT)條件下，ZEP(LOC_Os04g37619)基因的表達(dá)均明顯上調(diào)。該基因上游序列中有ABRE、MYC/MYB、DRE和EP2等順式作用元件，其表達(dá)可能受依賴于ABA（如ABRE、MYC/MYB元件）或不依賴于ABA（如DRE元件）的非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系調(diào)控。
　　 NCED4基因、NCED5基因、8'OX1基因、VD基因?qū)Ω啕}脅迫、低溫逆境、添加外源ABA等均有不同

11、程度的敏感性，其表達(dá)量均有不同程度的增加。
　　 ZEP酶的N-末端有一段脂溶性的“β片層-套環(huán)-α-螺旋”結(jié)構(gòu)，NCED酶蛋白N-末端有一段兩性（脂溶性和水溶性）α-螺旋，VDE序列中含有保守的4個(gè)His殘基和高電荷C-末端區(qū)，上述酶的這些特性與水稻在特定條件下通過調(diào)節(jié)酶的催化活性來適應(yīng)變化了的環(huán)境有關(guān)。
　　 ABA代謝及紫黃質(zhì)循環(huán)相關(guān)酶活性受基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、酶分子的脂溶性和水溶性、酶分子所在溶液的pH值等的調(diào)

12、節(jié)。
　　 第三，高鹽/低溫脅迫下ASC的氧化還原狀態(tài)及相關(guān)基因/蛋白質(zhì)表達(dá)分析。
　　 為了解逆境對(duì)水稻葉內(nèi)抗壞血酸含量及氧化還原狀態(tài)的影響，分別以高鹽和低溫脅迫為例，研究了它們對(duì)水稻葉內(nèi)抗壞血酸、脫氫抗壞血酸含量以及單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶(GLDH)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等四種酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果如下:
　　 逆境

13、下水稻葉內(nèi)H2O2含量逐漸增加，ASC/DHA比值不斷下降，且下降的幅度明顯大于對(duì)照。ASC/DHA比值是水稻葉內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除活性氧潛力的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　 MDHAR酶和DHAR酶分別催化MDHA和DHA還原生成ASC。逆境下編碼MDHAR酶的5個(gè)基因中有2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，編碼DHAR酶的2個(gè)基因中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。逆境下MDHAR酶和DHAR酶活性均有不同程度的增加，其變化趨勢(shì)與相關(guān)基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致。
　

14、　 GLDH酶催化半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫生成ASC，是ASC生物合成途徑中最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。GLDH酶位于線粒體內(nèi)膜，是膜結(jié)合酶。編碼GLDH酶的基因在逆境下表達(dá)上調(diào)，與GLDH酶活性增加的變化趨勢(shì)一致。
　　 APX酶催化H2O2還原為H2O，同時(shí)將ASC氧化為DHA，是清除H2O2，影響ASC/DHA比值的重要酶。逆境下編碼胞質(zhì)APX(APX1和APX2)的2個(gè)基因中有1個(gè)表達(dá)明顯上調(diào)，編碼過氧化物體APX(APX

15、3和APX4)的2個(gè)基因略有上調(diào)，編碼葉綠體基質(zhì)APX(APX5、APX6和APX7)和1個(gè)類囊體膜結(jié)合APX(APX8)基因均有不同程度的下降。通過同源建模，構(gòu)建了APX酶的3D結(jié)構(gòu)。APX酶含血紅素輔基，近端組氨酸的咪唑N是血紅素Fe(Ⅲ)的第五個(gè)配體、遠(yuǎn)端組氨酸位于血紅素輔基與H2O2結(jié)合的一側(cè)，離血紅素稍遠(yuǎn)，不與血紅素Fe(Ⅲ)成鍵，它是酶催化中心的活性位點(diǎn)，具有接受質(zhì)子的功能。當(dāng)APX與底物H2O2結(jié)合成為酶-底物復(fù)合體時(shí)，血

16、紅素Fe(Ⅲ)的第六個(gè)配位位置被H2O2分子占據(jù)。APX酶的第二個(gè)底物是ASC，位于血紅素輔基卟啉環(huán)γ位，與丙酸側(cè)鏈以氫鍵相連，并與相鄰R173/R179的胍基有兩個(gè)氫鍵相連，還與相鄰K31/T29的ε-氨基/β-OH以氫鍵相連。ASC不僅是抗壞血酸過氧化物酶的底物之一，而且在維持抗壞血酸過氧化物酶空間構(gòu)象方面起著非常重要的作用。
　　 與胞質(zhì)APX和過氧化物體APX相比，葉綠體基質(zhì)APX和類囊體膜結(jié)合APX分子中另有一個(gè)突環(huán)結(jié)

17、構(gòu)。組成突環(huán)的氨基酸殘基中，所有極性不帶電荷氨基酸位于突環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，且在ASC結(jié)合位點(diǎn)的附近形成了一個(gè)極性、中性的微環(huán)境，這種極性、中性的微環(huán)境有利于葉綠體基質(zhì)APX和類囊體膜結(jié)合APX在光下偏堿性（pH8左右）的基質(zhì)溶液中進(jìn)行催化反應(yīng)。
　　 通過對(duì)胞質(zhì)APX2基因和類囊體膜結(jié)合APX8基因的原核表達(dá)研究表明，APX2蛋白和APX8蛋白的分子量分別為28.2kD和44.7kD。動(dòng)力學(xué)分析表明，APX酶催化的生化反應(yīng)是雙底物（

18、ASC和H2O2）乒乓反應(yīng)，APX2酶和APX8酶對(duì)ASC和H2O2底物分別有不同的Km值。進(jìn)一步研究APX酶在不同pH反應(yīng)液中酶催化活性的變化，發(fā)現(xiàn)APX2酶和APX8酶的最適pH分別在6-7和7-8左右。APX8酶的最適pH在7-8左右，進(jìn)一步證明由突環(huán)構(gòu)建的極性、中性微環(huán)境，對(duì)葉綠體APX在偏堿性基質(zhì)中完成催化反應(yīng)的保護(hù)作用。
　　 逆境下ASC的氧化還原狀態(tài)（ASC/DHA比值）的變化是MDHAR基因/酶、DHAR基因/