家蠶二分濃核病毒VD1-ORF4編碼產(chǎn)物的鑒定及真核表達(dá).pdf

1、家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）是影響夏秋季蠶繭生產(chǎn)的主要病原微生物之一，對家蠶具有高致病性。該病毒主要感染家蠶中腸柱狀上皮細(xì)胞，致使家蠶罹患濃核癥，患病家蠶會(huì)出現(xiàn)空頭和下痢等癥狀。本課題組于2005年完成該病毒的基因組序列測定和分析工作，發(fā)現(xiàn)其基因組由VD1和VD2兩個(gè)單鏈DNA分子組成，VD1含有4個(gè)理論的開放閱讀框(ORF1，ORF2，ORF3，ORF4)，VD2基因組中含有2個(gè)理論

2、的開放閱讀框（ORF1，ORF2）。由于該病毒基因組的獨(dú)特性質(zhì)，2012年經(jīng)189個(gè)分類委員投票批準(zhǔn)，新設(shè)定一個(gè)二分DNA病毒科，下設(shè)一個(gè)二分濃核病毒屬，而BmBDV是該病毒科中的唯一代表種。
　　VD1-ORF4由3318 nts組成，理論上編碼一個(gè)由1105個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測其分子量大小為127 kDa、等電點(diǎn)為5.90，且與DNA聚合酶B家族同源，推測該蛋白質(zhì)可能是BmBDV病毒編碼的一個(gè)DNA聚合酶，與病毒DNA的

3、復(fù)制及病毒增殖有關(guān)。
　　為鑒定VD1-ORF4的編碼產(chǎn)物及它們的功能，本研究針對VD1-ORF4理論氨基酸序列制備相應(yīng)抗體，通過PCR擴(kuò)增VD1-ORF4序列上的兩個(gè)不同DNA片段，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)這兩個(gè)截短多肽，對獲得的原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，將純化后的抗原分別免疫昆明小鼠，獲得針對VD1-ORF4理論氨基酸序列不同抗原表位的抗血清;通過上海Abmart公司，定制VD1-ORF4理論氨基酸序列的單克隆抗體。通過這些抗體對

4、病毒感染的5齡家蠶中腸總蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)VD1-ORF4在病毒感染的家蠶中腸中編碼多個(gè)蛋白，其中包括一個(gè)約127 kDa的大蛋白以及70 kDa、53 kDa及45 kDa的小分子量蛋白，目前還不清楚這些蛋白的形成機(jī)制。通過免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)，對VD1-ORF4編碼產(chǎn)物的互作蛋白進(jìn)行初步分析，并通過GO分析得到其中235個(gè)蛋白的生物功能，其具體作用有待于進(jìn)一步研究。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)對VD1-ORF4編碼產(chǎn)物進(jìn)行亞細(xì)胞定位，通

5、過PCR擴(kuò)增桿狀病毒來源的極早期基因啟動(dòng)子，構(gòu)建了該啟動(dòng)子控制的VD-ORF4瞬時(shí)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物大都定位于細(xì)胞質(zhì)中，少部分能進(jìn)入細(xì)胞核中。以上結(jié)果，為進(jìn)一步揭示VD1-ORF4編碼產(chǎn)物的功能提供基礎(chǔ)。
　　為獲得VD1-ORF4編碼的蛋白，本研究通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus expressionvector system，BEVS)表達(dá)VD1-ORF4來源的3個(gè)DNA片段，包括全

6、長片段(3318 bp)以及兩個(gè)部分長度的DNA片段(1320 bp和2160 bp);為便于重組病毒粒子的鑒定，本研究對野生型桿狀病毒穿梭載體(bacmid)進(jìn)行了改造，將綠色熒光蛋白基因引入到bacmid的非必需位點(diǎn)，進(jìn)而利用改造后的載體表達(dá)VD1-ORF4全長序列及部分序列。Western b1ot分析發(fā)現(xiàn)全長片段(3318bp)表達(dá)時(shí)能在70 kDa處雜交到一條很特異的帶，而部分長度片段（1320bp和2160bp）的表達(dá)卻很不

7、理想，沒有鑒定到靶蛋白的表達(dá)，推測VD1-ORF4編碼的蛋白可能具有特殊的理化性質(zhì)，不易在BEVS中表達(dá);同時(shí)，本研究構(gòu)建了在桿狀病毒極早期基因啟動(dòng)子控制下的，VD1-ORF4的C端與EGFP的N端融合表達(dá)的瞬時(shí)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)，視野中能觀察到的熒光數(shù)量很少，而在只表達(dá)EGFP的對照組中，整個(gè)視野中布滿了綠色熒光，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了VD1-ORF4不適于在BEVS中表達(dá)。
　　本研究從分子水平上對VD1-O