擬穴青蟹與中華絨螯蟹幾個脅迫響應相關基因的克隆與表達分析.pdf

1、擬穴青蟹是我國沿海重要的海洋經(jīng)濟蟹類,具有較大的商品價值,但在人工養(yǎng)殖過程中容易受病原體的侵蝕擾亂、和環(huán)境的污染而導致其繁殖和養(yǎng)殖過程中存活率較低,這嚴重制約了我國養(yǎng)殖擬穴青蟹的發(fā)展。中華絨螯蟹也是我國南方廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟蟹類,近年來,中華絨螯蟹的養(yǎng)殖由于密集養(yǎng)殖面臨著嚴峻的死亡問題。除改善環(huán)境因素外,了解蟹類自身的免疫防御機制才能更有效的進行蟹類的健康養(yǎng)殖。
　　本論文擬從分子生物學的角度,借助cDNA末端快速擴增(RACE)、熒

2、光定量PCR技術(shù)和GeXP多重PCR技術(shù),對與擬穴青蟹和中華絨螯蟹免疫相關的基因進行克隆和表達模式分析,探討這些基因在青蟹免疫過程中的作用,為擬穴青蟹和中華絨螯蟹的免疫機制提供基礎資料。主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)廣泛地存在于生物界中,是一種低分子量(12 KD)、有還原雙硫鍵活力的蛋白質(zhì)。越來越多的研究表明,它是重要的酶活力調(diào)節(jié)蛋白,參與許多重要的生命活動。運用克隆測序和SMART

3、技術(shù)從擬穴青蟹的肝胰腺cDNA文庫中分離得到了一條cDNA全長序列,通過Mega軟件比對發(fā)現(xiàn),這條cDNA序列與其他物種硫氧還蛋白基因之間具有較高的同源性,經(jīng)綜合分析確定為硫氧還蛋白基因(SpTrx2)。擬穴青蟹硫氧還蛋白基因由1336 bp組成,包含一個396bp的開放閱讀框,它編碼一個分子量約為14450道爾頓,等電點為8.08的蛋白。該基因編碼的硫氧還蛋白與三疣梭子蟹的硫氧還蛋白序列有87％相似度。運用Quantitative r

4、eal-time PCR技術(shù),研究了硫氧還蛋白基因在擬穴青蟹的肌肉、心臟、肝胰腺、精巢、鰓、血液等各個不同組織的時空表達差異,檢測的各個組織硫氧還蛋白基因均有表達,其中鰓和肝胰腺中硫氧還蛋白基因的表達量最高,血液中表達量最低。用副溶血性弧菌注射成體擬穴青蟹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SpTrx2 mRNA表達量在感染副溶血性弧菌后明顯提高,6小時后達到最高水平,在12 h后表達量下降一些,24 h后兩者的SpTrx表達量回歸正常水平。硫氧還蛋白可能在擬

5、穴青蟹的免疫和抗菌過程中具有重要作用。本實驗為深入研究擬穴青蟹硫氧還蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎。
　　2.用實時定量RT-PCR檢測不同鹽度(0,2,5,10 and15ppt)對中華絨螯蟹Na+-K+-ATPase，Hsp70(Heat Shock Protein70) and Hsp90(Heat Shock Protein90)基因表達的影響。結(jié)果表明在低濃度和高濃度鹽度刺激下,Na+-K+-ATPase，Hsp70 an

6、d Hsp90三個基因的表達量都會發(fā)生顯著變化,鹽度高低及耐受時間長短對Na+-K+-ATPase，Hsp70 and Hsp90三個基因表達水平產(chǎn)生不同影響,這說明Na+-K+-ATPase，Hsp70 and Hsp90三個基因在中華絨螯蟹的對鹽度刺激耐受性上起著很大的作用。
　　3.用GeXP技術(shù)檢測銅刺激對中華絨螯蟹幾個免疫相關基因表達的影響。結(jié)果表明在低濃度和高濃度銅刺激下,toll樣受體(Toll-like recep

7、tor),硫氧還蛋白(thioredoxin)和金屬硫蛋白(metallothionein)三個基因的表達量都會發(fā)生顯著變化,這說明這三個基因可能在中華絨螯蟹重金屬吸收和代謝上具有一定功能。HSP70、HSP90和小泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier-1)的分析結(jié)果表明,在銅離子刺激的條件下,在96小時之內(nèi),Hsp70、Hsp90和small ubiquitin-like modifier-1基因的