大豆苗期耐低磷性狀評價和低磷脅迫的分子機理初步研究.pdf

1、磷是植物生長和新陳代謝所需一種最重要大量元素之一，同時也是核酸、磷脂、ATP、酶、輔酶的一種關鍵性成分。磷（植物主要吸收磷酸鹽形式的磷）缺乏是限制植物生長的第二位的大量元素，其在土壤中以復雜的、難溶的、無機和有機形式存在，不能被植物直接吸收。植物的正常生長和產(chǎn)量依賴于可利用性Pi（InorganicPhosphate，磷酸鹽），然而在很多自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中植物經(jīng)常會出現(xiàn)有效和可溶性磷極度缺乏的情況。為了適應磷缺乏，植物已進化獲得精巧的

2、調(diào)控機制來保持體內(nèi)磷的動態(tài)平衡，包括側根和根毛的發(fā)育、根系構型改變（例如蛋白樣和胡蘿卜狀根的形成）、從根系分泌磷酸酶和有機酸、高低親和性磷酸鹽轉運體（phosphatetransporter,PT）的誘導。同時很多植物與茵根真菌形成共生關系以便獲得更多的Pi。在植物中存在著很多的適應性機制以減輕或應對磷缺乏。這些機制的實現(xiàn)是通過幾百個基因表達譜的變化來實現(xiàn)的。這些感知Pi狀態(tài)和調(diào)整適應機制的調(diào)節(jié)基因組成網(wǎng)絡現(xiàn)在逐漸清晰。目前已鑒定的該網(wǎng)

3、絡組成包括轉錄因子、SPX(Syg1，Pho81，XPR1)亞家族蛋白、非編碼RNA和蛋白修飾物（包括參與SUMO化、磷酸化、去磷酸化以及蛋白運輸?shù)母鞣N蛋白）。
　　本研究克隆了PT、PHR（(ph)hosphatestarvationresponse）、SPX和Gm4等相關基因;并利用生物信息學方法研究了GmPT1和GmPT2蛋白結構;采用綠色熒光蛋白融合PT來研究GmPT1和GmPT2的亞細胞定位;在酵母突變體中研究GmPT1

4、和GmPT2功能和生化特征;采用Real-timeRT-PCR研究GmPT1和GmPT2表達模式;利用酵母單雜交的方法研究GmPHR1和GmSPX1的互作;同時，利用主成分分析和隸屬函數(shù)對20種大豆基因型進行了耐低磷性狀的評價。通過研究獲得以下研究結果:
　　1.根據(jù)主成分和隸屬函數(shù)分析，評價供試大豆基因型耐低磷性狀強弱順序。供試基因型耐低磷由強到弱的順序為:趕泰、五河齊黃豆、7650、湘豆4號、先進2號、蘇88M-21、Peki

5、ng、高作選1號、科豐一號、新沂小黑豆、南農(nóng)1138-2、94-156、87-23、菏84-5、波高、RN-9、通山薄皮甲、皖82-178、湘秋豆2號、墊江早黃豆。
　　2.克隆得到兩個PT基因分別在大豆染色體Gm10(41，391，168～41，393，008)和Gm20(42，980，124～42，981，928)上，分別命名為GmPT1(登錄號:HQ392508)、GmPT2（登錄號:HQ392509）。GmPT1含有184

6、1個堿基其開放閱讀框編碼536個氨基酸（分子量為58730.46Da）。GmPT2含有1802個堿基其開放閱讀框編碼536個氨基酸（分子量為58627.29Da）。GmPT1和GmPT2的開放閱讀框都是從第23～1633bp，在核苷酸序列上有88.7％一致性，在氨基酸序列上有97.9％的一致性。GmPT1和GmPT2氨基酸序列與擬南芥、番茄、馬鈴薯和蒺藜苜蓿有著很高相似性。GmPT1和GmPT2與來自真菌的PT——茵根真菌(GvPT)以

7、及釀酒酵母(PHO84)有著很高的一致性。GmPT1氨基酸序列與GvPT（登錄號:Q00908）、PHO84（登錄號:P25297）分別有76％、61％一致性;GmPT2氨基酸序列與GvPT（登錄號:Q00908）、PHO84（登錄號:P25297）分別有76％、63％一致性。GmPT1和GmPT2的疏水性分析表明這兩個轉運體均有12個跨膜區(qū)域（TM，transmembrane），這是PT的共同特征，與PT的親和性無關。GmPT1和Gm

8、PT2的生物信息學預測結果表明這兩個蛋白的二級結構含有12個跨膜區(qū)域，在TM6和TM7間存在一個大親水環(huán)。
　　3.利用Tbpred預測服務器來預測GmPT1和GmPT2亞細胞定位，其預測結果為GmPT1和GmPT2是整合性膜蛋白。為了驗證GmPT1和GmPT2亞細胞定位，將綠色熒光蛋白(GFP)融合到GmPT1或GrPT2的ORF的3，端。在以GmPT1/GFP或GmPT2/GFP進行轉化的細胞可以觀察到細胞周圍有著清晰的熒光信

9、號，轉化空載的細胞則可以觀察到整個細胞充滿熒光信號。GmPT1/GFP和GmPT2/GFP融合蛋白定位在細胞的周邊，表明這兩個蛋白定位在細胞膜。這個結果與早期生化研究一致，這些數(shù)據(jù)表明GmPT1和GmPT2定位在細胞膜。
　　4.利用抑制劑來驗證Pi運輸?shù)膒H依賴性。Pi運輸活性在pH值4～7范圍內(nèi)進行研究，其活性在不同的pH值下表現(xiàn)出差異——當pH值為4時其活性達到最高并隨著pH值升高其活性下降。為了研究質(zhì)子驅動力對Pi運輸活性

10、的影響，本實驗使用解偶聯(lián)劑——2，4-二硝基苯酚(DNP)和羰基羥基氰氯苯腙(CCCP)，這些解偶聯(lián)劑可以破壞細胞膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度。DNP在濃度為100μM時Pi吸收率相比較無抑制劑的對照減至79％(GmPT1)和82％(GmPT2)。CCCP在濃度為100tM時Pi吸收率相比較無抑制劑的對照減至77％（GmPT1）和80％(GmPT2)。釩酸鹽——一種P-類型H+-ATPase抑制劑——在濃度為100μM時Pi吸收率相比較無抑制劑的對

11、照減至82％(GmPT1)和83％(GmPT2)。這些結果表明其吸收率相比較對照明顯地降低了。這些結果證實了GmPT1和GmPT2的Pi/H+共轉運依賴于細胞膜內(nèi)外的pH梯度，其pH梯度的維持正是質(zhì)膜上的H+-ATPase的作用。競爭實驗表明不同的陽離子不會降低Pi吸收速率，表明GmPT1和GmPT2對Pi吸收的高度特異性。含有GmPT1和GmPT2的菌株在毫摩爾濃度(mM)的Pi濃度下其吸收率與含空載的菌株相似。在32pi吸收實驗中，

12、其吸收過程中的前5min吸收速率是線性的，利用Lineweaver-Burk圖可以計算GmPT1和GmPT2的Km，得到GmPT1和GmPT2的Km分別為6.65mM和6.63mM。因此，GmPT1和GmPT2是低親和PT并且依賴于質(zhì)膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度。
　　5.播種7d后的大豆幼苗的根系、莖和葉片組織用于研究GmPT1和GmPT2的表達。在低磷脅迫的48h之內(nèi)，幼苗的根系、莖和葉片中GmPT1和GmPT2的表達量都是升高的。48h

13、高磷處理后，將幼苗進行低磷脅迫，3h后其幼苗的根系、莖和葉片中GmPT1和GmPT2的表達量也是上調(diào)的。用Hoagland營養(yǎng)液澆灌的幼苗移栽到高磷溶液后，其幼苗的GmPT1和GmPT2的表達量只有輕微的改變。48h低磷處理的幼苗移栽到高磷溶液3h后，其根系、莖和葉片中的GmPT1和GmPT2的表達量降低。然而，GmPT1和GmPT2基因的表達水平并沒有受到磷濃度影響而顯著地改變（其相對倍數(shù)變化是很小的）并且這種變化趨勢是復雜的，這表明